基于表面修飾技術(shù)的新型生物傳感器的構(gòu)建及應(yīng)用研究.pdf

1、表面修飾是生物傳感器構(gòu)建過程中最關(guān)鍵的步驟，通過表面修飾技術(shù)，方便地將生物活性物質(zhì)和固定化材料固定于生物傳感器表面，設(shè)計(jì)特定的分子結(jié)構(gòu)單元來賦予膜特定的功能，使構(gòu)建的傳感器具有許多優(yōu)點(diǎn)，如靈敏度高、響應(yīng)快、特異性強(qiáng)、壽命長等。本論文研究工作主要以表面修飾技術(shù)為主線，結(jié)合納米材料構(gòu)建了新型催化型生物傳感器，將其應(yīng)用于實(shí)際樣品檢測；以及可應(yīng)用于基于細(xì)胞因子和受體相互作用的中藥有效成分作用機(jī)理研究的親和型生物傳感技術(shù)，將其應(yīng)用于活血化瘀中藥有

2、效成分赤芍801作用機(jī)理的研究中。 論文的主要內(nèi)容如下： 1.基于表面修飾技術(shù)的新型催化型生物傳感器的構(gòu)建及應(yīng)用研究。利用層層累積(LBL)、溶膠-凝膠(sol-gel)表面修飾技術(shù)結(jié)合多壁納米碳管(MWCNTs)制備了葡萄糖生物傳感器和L-乳酸生物傳感器。分別對酶電極的制備過程參數(shù)以及傳感器的性能進(jìn)行了研究。發(fā)現(xiàn)： 基于LBL表面修飾技術(shù)制備的葡萄糖生物傳感器對葡萄糖的響應(yīng)電流值隨著(MWCNTs/GOx)n復(fù)

3、合薄膜層數(shù)的不同而變化，當(dāng)(MWCNTs/GOx)n復(fù)合薄膜的層數(shù)為6時(shí)，響應(yīng)電流值達(dá)到最大。(MWCNTs/GOx)6復(fù)合薄膜修飾的葡萄糖生物傳感器對3×10-2moll-1的葡萄糖的響應(yīng)電流為1.63μA，響應(yīng)時(shí)間僅為6.7s。該生物傳感器檢測的線性范圍為5×10-4mol1-1～1.5×10-2moll-1，最低檢測濃度可達(dá)0.9×10-4moll-1。 基于sol-gel表面修飾技術(shù)制備的葡萄糖生物傳感器中，sol-ge

4、l膜的構(gòu)建優(yōu)化條件是H2O：TEOS為2.5～3.5、TritonX-100濃度5％、pH5.5。在本實(shí)驗(yàn)條件下，多壁納米碳管的最適固定量為5μl(0.25gl-1)，溶膠-凝膠與酶的優(yōu)化體積比為3：2。工作電位+0.55V、pH6.5、25℃為所制備的傳感器的最適工作條件。該傳感器對葡萄糖在0.5-6mmoll-1呈線性響應(yīng)，響應(yīng)時(shí)間為15s，檢出限為0.05mmoll-1。傳感器的穩(wěn)定性好，45天時(shí)的響應(yīng)值仍保持90％。 基

5、于sol-gel表面修飾技術(shù)制備了L-乳酸傳感器，結(jié)果表明：加入納米碳管以后生物傳感器的分析特性被明顯提高。加入納米碳管之前生物傳感器的敏感性，線性范圍、最低檢測限(S/N=3)分別是2.097μAmM-1，0.3-1.5mM，0.8×10-3mM。加入納米碳管以后生物傳感器的敏感性，線性范圍、最低檢測限(S/N=3)分別是6.031μAmM-1，0.2-2.0mM，0.3×1003mM。該傳感器已經(jīng)成功地應(yīng)用于實(shí)際血樣中L-乳酸的檢測

6、。 利用鉑納米顆粒和多壁納米碳管結(jié)合sol-gel技術(shù)構(gòu)建了增效的電流型L-乳酸傳感器。+0.5V電壓、pH6.4、室溫是該傳感器的最適工作條件。在此優(yōu)化的條件下，該傳感器具有寬的檢測范圍(0.2-2.0mM)、短的響應(yīng)時(shí)間(5秒)、高的靈敏性(6.36μAmM-1)、好的穩(wěn)定性(4周連續(xù)檢測后活性保持90％)。構(gòu)建的該傳感器具有很好的抗干擾能力。通過該傳感器對實(shí)際血樣樣品的檢測的結(jié)果表明：該傳感器的檢測結(jié)果與傳統(tǒng)的分光光度法具

7、有很好的一致性。 2.基于表面修飾技術(shù)的親和型生物傳感器的構(gòu)建及應(yīng)用研究。構(gòu)建了基于生物素-親和素和CMD表面修飾技術(shù)的IAsys和QCM生物傳感技術(shù)。并將其應(yīng)用于細(xì)胞因子和受體相互作用及活血化瘀中藥有效成分赤芍801的作用機(jī)理研究。 分別應(yīng)用基于生物素-親和素和CMD表面的親和型生物傳感技術(shù)一IAsys生物傳感技術(shù)和QCM生物傳感技術(shù)研究赤芍801與細(xì)胞因子受體之間的相互作用。并進(jìn)一步揭示赤芍801在體內(nèi)的作用靶點(diǎn)及作

8、用機(jī)理。通過生物素-親和素和CMD表面修飾技術(shù)，將ET-1、sIL-2R和sIL-6R固定于IAsys生物傳感器的樣品池表面和QCM基片的表面，分別用IAsys和QCM檢測它們與赤芍801、IL-2和IL-6的特異性相互作用，并對赤芍801對IL-2與sIL-2R、IL-6與sIL-6R相互作用的影響進(jìn)行了研究。發(fā)現(xiàn)： ET-1分別以1.21ngmm-2和291.22ngcm-2的密度固定于IAsys樣品池表面和QCM基片表面，

9、赤芍801可與其發(fā)生特異性親和反應(yīng)，結(jié)合量分別為1.28ngmm-2和135.92ngcm-2。因而可以阻斷ET-1與其受體間的結(jié)合，從而拮抗ET-1的生物學(xué)活性，擴(kuò)張血管，抑制血小板聚集。這可能是赤芍801心血管保護(hù)作用的機(jī)理之一，也就是說除了TXA2之外，ET-1可能是赤芍801在體內(nèi)的另一個(gè)作用靶點(diǎn)。 sIL-2R分別以0.754ngmm-2和170.48ngcm-2的密度固定于IAsys樣品池和QCM基片表面，IL-2可

10、與其發(fā)生特異性、濃度依賴性親和反應(yīng)，結(jié)合量分別是0.404ngmm-2和44.46ngcm-2。應(yīng)用FASTfit軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合并計(jì)算其反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)常數(shù)，結(jié)合速率常數(shù)kass=3.83×104M-1s-1，解離速率常數(shù)kdiss=1.91×10-2s-1，則KD=4.99×10-7M，KA=2.O×106M-1。赤芍801能夠增加IL-2和sIL-2R之間的結(jié)合量。 sIL-6R以0.996ngmm-2的密度固定于樣品池表面，

11、以297.08ngmm-2的密度固定于QCM基片表面，IL-6可與其發(fā)生特異性、濃度依賴性親和反應(yīng)，結(jié)合量為0.337ngmm-2和33.70ngcm-2。應(yīng)用FASTfit軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合并計(jì)算其反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)常數(shù)，結(jié)合速率常數(shù)kass=1.28×104M-1s-1，解離速率常數(shù)kdiss=1.89×10-4s-1，則KD=1.48×10-8M，KA=6.76×107M-1。赤芍801能夠增加IL-6和sIL-6R之間的結(jié)合量，從而影響