水稻條紋病毒NS3對灰飛虱Dicer-2蛋白RNaseⅢ功能域的影響分析.pdf

1、由水稻條紋病毒（Rice stripe virus，RSV）引起的水稻條紋葉枯病給我國的水稻生產(chǎn)造成了巨大損失。該病毒由介體灰飛虱(Laodelphax striatellus Fallén)傳播，能夠在介體內循回增殖且經(jīng)卵傳播給后代。目前，病毒如何適應介體灰飛虱的抗病毒免疫反應機制尚不清楚。有研究發(fā)現(xiàn)NS3是RSV的基因沉默抑制子，很可能在RSV侵染灰飛虱的過程中起到重要的作用。本文以RSV-NS3作為誘餌蛋白篩選灰飛虱酵母雙雜交cD

2、NA文庫，篩選到一系列灰飛虱體內與NS3互作的蛋白因子，并且對一個關鍵因子RNaseⅢ（Dicer-2的一個功能域）與NS3蛋白之間的相互進行了進一步分析。
　　1、利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選灰飛虱體內與RSV-NS3互作蛋白因子
　　構建誘餌蛋白酵母雙雜交載體pGBKT7-NS3，并將其轉入酵母菌AH109中，利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選灰飛虱cDNA文庫，PCR篩選出插入片段大于500 bp的酵母質粒轉化大腸桿菌，測序分析。在Ge

3、nbank數(shù)據(jù)庫中Blast比對后，確定插入片段的基因屬性，最后獲得10個不同的基因，分別是卵黃原蛋白、含C2結構域蛋白、RNaseⅢ domain、MD-2相關脂質識別蛋白樣亞型1、DUF1639超家族蛋白、DUF4497超家族蛋白、TweedleE（DUF243超家族蛋白）、熱激蛋白70、類Icarapin蛋白、含BTB/POZ結構域蛋白2。
　　2、灰飛虱RNaseⅢ與 RSV-NS3互作驗證
　　根據(jù)文庫篩選結果，我

4、們主要針對RNaseⅢ（Dicer-2蛋白的一個功能域）做了重點研究。分析Dicer-2蛋白功能結構，確定其RNaseⅢ功能域，并克隆其基因，利用酵母雙雜交實驗進一步驗證了RNaseⅢ與NS3蛋白的互作關系。
　　3、RNaseⅢ的切割活性分析
　　構建RNaseⅢ的原核表達載體，在大腸桿菌BL21(DE3)中進行了原核表達，經(jīng)純化獲得了純化的RNaseⅢ蛋白。純化的RNaseⅢ與dsGFP孵育進行切割活性分析，結果顯示:純

5、化的RNaseⅢ具有切割dsRNA的活性。采用二倍稀釋法逐級稀釋RNaseⅢ蛋白后進行切割活性分析，確定了RNaseⅢ的有效濃度為6 ng/μL。延長反應時間進行切割活性分析，結果顯示:反應時間延長有助于RNaseⅢ蛋白切割功能的增強。
　　4、NS3蛋白對RNaseⅢ切割活性的影響
　　在大腸桿菌BL21(DE3)中原核表達NS3蛋白，經(jīng)純化獲得了純化的NS3蛋白。在RNaseⅢ切割dsRNA體系中加入純化的NS3蛋白孵育

6、，發(fā)現(xiàn)NS3促進了RNaseⅢ對dsRNA切割。同時，初步建立了可介導RNA沉默(RNAi)的灰飛虱胚胎提取物(EmbryoLysate)體系，該體系中灰飛虱體內的Dicer-2蛋白RNaseⅢ功能域也具有切割dsRNA的活性。在Embryo Lysate體系中加入NS3與dsRNA孵育，結果顯示NS3同樣促進了RNaseⅢ功能域對dsRNA的切割。
　　之前研究報道NS3不能結合dsRNA，但可以結合siRNA，以抑制沉默復合體