肝癌靶向單鏈抗體的篩選與親和力測定.pdf

1、原發(fā)性肝癌世界上惡性程度極高，且預后極差的惡性腫瘤之一，其中90％以上為肝細胞癌(HepatocellularCarcinoma，HCC)，全球每年因HCC而死亡的患者超過100萬。在我國肝癌目前已處于惡性腫瘤死亡率的第二位，每年至少有10萬名新發(fā)現(xiàn)病人，和11萬名肝癌病人死亡。盡管目前肝癌能夠早期發(fā)現(xiàn)，且治療方法有許多種，但治療效果都十分有限，并未顯著延長病人的生存期。大部分肝癌病人對化療及放療等治療均不敏感，能手術根治的病人僅占15

2、％。近年來，隨著分子生物學和免疫學的不斷發(fā)展，對癌基因的認識不斷深入，以及轉基因技術的日趨完善，肝癌基因治療已顯示出一定的前景。成為繼手術、放療和化療之后第4種治療模式。載體問題一直是肝癌基因治療研究領域的核心技術之一。肝癌基因治療常用的載體主要分兩大類：病毒載體和非病毒載體。病毒載體存在非導向性、有限的攜帶能力、生產(chǎn)和包裝以及安全性的困擾等問題；近年來，非病毒載體以其安全性，低毒性，低免疫反應，靶向性及易于組裝等優(yōu)點被寄予厚望。其中，

3、研究具有肝癌靶向特異性分子是需首要解決的問題， 去唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)是肝臟的一種重要且高效的內吞受體，主要分布于肝小葉門靜脈周圍肝細胞的竇面膜微絨毛間隙(MicrovilliClefts)，配體能否在微絨毛間有效滲透可能也是決定ASGPR介導的內吞的一個重要。腎臟的濾過的閾值是60-70kDa，單鏈抗體作為配體不經(jīng)修飾很快從腎臟濾過。Wu等第一次利用ASGP作為配體，將DNA靶向性導入了ASGPR表達陽性的細胞(He

4、pG2)細胞，但由于天然配體分子大、來源困難以及潛在的生物危險性，目前更傾向于通過生物工程手段獲得靶向分子。至今，已證實有多種去唾液酸糖蛋白受體的配體可有效介導靶向性DNA轉移至肝癌細胞。如半乳糖基多聚賴氨酸(Lac-PLL)、半乳糖基脂質體、半乳糖基聚乙烯亞胺、半乳糖化的膽固醇、醣脂類等。研究表明：scFv可以模擬配體的功能，將目的基因導入到靶細胞中，通過受體介導的內吞作用將目的基因導入靶細胞中。王騫等用抗TfR的單鏈抗體，將HSV-

5、tk基因有效地導入肝癌細胞HepG2。 噬菌體抗體庫是近年發(fā)展起來的一項分子生物學新技術。構建容量大、特異性高、穩(wěn)定性高和敏感性強的人源性抗體是此項技術的核心，也是其遠大前景的基礎。噬菌體抗體是指在其表面表達有Fab抗體或單鏈抗體(scFv)的噬菌體。用基因克隆技術將B細胞全套可變區(qū)基因克隆出來，組裝到表達載體內并表達到噬菌體表面形成噬菌體抗體的群體，即為噬菌體抗體庫。經(jīng)特定抗原或細胞篩選后，便可獲得特異性抗體。 本研究

6、將利用抗體庫技術，體外篩選、克隆、表達去唾液酸糖蛋白受體的單鏈抗體，并對單鏈抗體的篩選進行了改進，進一步提高篩選的陽性率，并對所獲得的單鏈抗體進行親和力測定，使有利于作為肝癌基因治療的靶向分子，為其作為肝癌的基因治療能在體內應用成為可能奠定基礎。 [目的] 從人源噬菌體抗體庫(TomlinsonILibrary)中篩選與ASGPR特異性結合的單鏈抗體。采用捕獲噬菌體ELISA法，從人源抗體庫中篩選抗ASGPR的單鏈抗體，

7、并與間接噬菌體ELISA法相比較。對單鏈抗體的篩選方法進行了改進，進一步提高篩選的陽性率，并對所獲得的單克隆噬菌體進行可溶性表達、純化后進行親和力測定，對其抗原結合性質進行鑒定。使有利于作為肝癌基因治療的靶向分子，為其作為肝癌的基因靶向能在體內應用奠定基礎。 [結論] 在原核表達系統(tǒng)中成功表達和純化得到重組去唾液酸糖蛋白受體，該重組去唾液酸糖蛋白受體具有較強的免疫原性；以該重組去唾液酸糖蛋白受體作為抗原篩選Tomlins