轉化生長因子TGF-β1對大鼠椎間盤細胞自噬與凋亡的影響.pdf

1、第一部分，TGF-β1是否參與椎間盤細胞自噬與凋亡的調節(jié)
　　目的:觀察退變大鼠椎間盤組織中TGF-β1表達情況，及其與椎間盤細胞自噬與凋亡的關系。
　　方法:制作大鼠腰椎動靜力失穩(wěn)模型，HE染色檢測腰椎間盤退變程度，TUNEL染色原位檢測細胞凋亡率，免疫組化染色檢測TGF-β1表達。Western blot檢測TGF-β1、LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1、pro-caspase-3和cleaved caspase-3蛋白表

2、達。最后分析TGF-β1是否參與椎間盤細胞自噬與凋亡的調節(jié)。
　　結果:成功制作大鼠動靜力失穩(wěn)椎間盤退變模型。隨著造模時間延長，HE染色顯示大鼠腰椎椎間盤退變程度逐漸加重;免疫組化也顯示手術組大鼠椎間盤內TGF-β1表達逐漸增高，在6月時最高，12月時又逐漸下降，但三個時間點表達均高于假手術組;TUNEL染色顯示細胞凋亡在手術組大鼠椎間盤明顯高于假手術組。Western blot顯示TGF-β1在兩組動物模型中的表達趨勢與自噬標記

3、蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ和Beclin-1一致。但凋亡標記蛋白pro-caspase-3和cleaved caspase-3的表達在手術組大鼠椎間盤內的表達水平明顯高于假手術組，并隨著退變的加重逐漸增高。
　　結論:TGF-β1表達于椎間盤退變組織，并隨著退變加重逐漸增高，退變后期表達反而下降;TGF-β1可能通過調節(jié)椎間盤細胞的自噬與凋亡參與椎間盤退變的過程。
　　第二部分，TGF-β1在血清剝奪誘導的纖維環(huán)細胞自噬與凋亡相互作用

4、中的研究
　　目的:本研究旨在明確TGF-β1對椎間盤細胞中自噬與凋亡的作用，并為預防及治療椎間盤退變提供有效的分子生物學證據。
　　方法:大鼠纖維環(huán)細胞經分離、培養(yǎng)、傳代后予以血清剝奪12、24、36、48小時來誘導自噬及凋亡。加入TGF-β1并使之在培養(yǎng)液內的終濃度為分別為5、10及20 ng/mL。同時應用自噬促進劑3-MA及自噬阻斷劑BafA并觀察TGF-β1與血清剝奪誘導的纖維環(huán)細胞自噬與凋亡之間的關系和可能的作用

5、機制。
　　結果:10 ng/mL TGF-β1能夠顯著抑制血清剝奪48小時誘導的纖維環(huán)細胞過度自噬并減少凋亡。TGF-β1通過增強ERK1/2、p-AKT、p-mTOR的磷酸化并下調LC3Ⅱ/Ⅰ及cleaved caspase-3的表達，并能夠部分降低自噬促進劑3-MA增強的自噬及凋亡水平。TGF-β1能協同自噬抑制劑Baf A進一步抑制自噬及凋亡。3-MA能夠同時阻斷ERK、AKT和mTOR的磷酸化，部分上調由TGF-β1抑制

6、的LC3Ⅱ/Ⅰ及cleaved caspase-3水平。
　　結論:TGF-β1能夠通過下調過度的自噬從而降低血清剝奪誘導的纖維環(huán)細胞的凋亡，PI3K-AKT-mTOR及MAPK-ERK1/2通路是TGF-β1發(fā)揮效應的可能機制。
　　第三部分，TGF-β1抑制外源性過氧化氫誘導的纖維環(huán)細胞自噬與凋亡
　　目的:本研究旨在明確TGF-β1對過氧化氫誘導的纖維環(huán)細胞自噬與凋亡的作用，并探討其可能的作用機制。
　　方

7、法:大鼠纖維環(huán)細胞經分離及培養(yǎng)、傳代后全血清培養(yǎng)，加入不同濃度的過氧化氫（使之終濃度為分別為50、100及200μmol/L）0.5、1、2、4小時。加入TGF-β1并使之在培養(yǎng)液內的終濃度分別為5、10及20 ng/mL）。同時應用自噬阻斷劑BafA及多種凋亡阻斷劑來觀察TGF-β1對過氧化氫誘導的自噬與凋亡之間的關系和可能的作用機制。
　　結果:過氧化氫能明顯抑制纖維環(huán)細胞的活力并有劑量依賴及時間效應。過氧化氫通過激活ERK促

8、進細胞自噬與凋亡。100μmol/L過氧化氫刺激1h后自噬水平即達到峰值。過氧化氫誘導的細胞凋亡主要通過內源性凋亡通路。TGF-β1能夠抑制過氧化氫對纖維環(huán)細胞的毒性作用。TGF-β1可以抑制過氧化氫刺激1h后上調的Beclin-1及LC3Ⅱ/Ⅰ的表達，同時通過抑制Bax/Bcl-2、上調線粒體膜電位而減少細胞色素C的釋放，減少caspase-9及caspase-3的水平。TGF-β1的保護作用通過抑制ERK實現。TGF-β1能夠上調谷