抗菌肽LL-37的原核表達純化及對外陰陰道假絲酵母菌病的療效研究.pdf

1、目的:通過構(gòu)建LL-37原核表達載體，優(yōu)化表達條件，純化獲得具有生物活性的LL-37重組蛋白。通過細胞及動物實驗，探討重組LL-37蛋白對外陰陰道假絲酵母菌病(VVC)的療效及作用機制。
　　方法:1）通過基因工程構(gòu)建LL-37原核表達載體pET-Duet/LL-37。轉(zhuǎn)化入大腸桿菌(Ecoli)M15菌株后，異丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)進行誘導表達。通過調(diào)控誘導劑濃度及誘導時間優(yōu)化誘導條件。經(jīng)鎳離子金屬螯合(NI-IDA

2、)親和層析純化蛋白并進行蛋白復性，BCA法測定純化蛋白濃度。KB紙片法初步驗證純化蛋白的抗真菌活性。2）分步消化法原代培養(yǎng)人陰道上皮細胞，傳至第4代進行實驗。將陰道上皮細胞與假絲酵母菌按1∶1共培養(yǎng)，構(gòu)建VVC細胞模型，分對照組和實驗組。實驗組加入純化LL-37蛋白進后繼續(xù)培養(yǎng)，對照組加入等量PBS溶液。分別于12h、24h、48h收集各組上清液。倒置顯微鏡觀察兩組不同時間段陰道上皮細胞及假絲酵母菌生長情況，采用葡萄糖消耗法比較兩組抑菌

3、效果（以吸光度A值表示）;酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測兩組不同時間段IFN-γ、 IL-10濃度及IFN-γ/IL-10比值的變化。3）通過定期雌激素皮下注射，構(gòu)建小鼠VVC模型。將30只雌性昆明小鼠隨機分為對照組及實驗組。實驗組在成模后每天陰道灌入LL-37進行治療連續(xù)5天，對照組以PBS溶液灌洗。5天后取小鼠陰道灌洗液及陰道壁組織，比較兩組灌洗液涂片情況及載菌量變化。ELISA檢測陰道壁組織勻漿中IL-10、IFN-γ濃度，比

4、較兩組IFN-γ/IL-10比值的變化。
　　結(jié)果:1）成功構(gòu)建pET-Duet/LL-37表達載體。重組蛋白主要以包涵體形式表達。優(yōu)化表達條件:IPTG0.5mmol/l，誘導時間6小時。純化得到濃度為433.92ug/ml，純度可達96％的重組蛋白。KB紙片法證實純化蛋白具有一定的抗真菌活性。2）成功構(gòu)建VVC細胞模型。隨著培養(yǎng)時間延長，對照組可見假絲酵母菌生長旺盛，吸光度呈明顯下降趨勢。實驗組陰道上皮細胞存活情況好于對照組，

5、假絲酵母菌生長明顯受到抑制。各時間段吸光度值均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義，并且下降趨勢較對照組緩慢。ELISA結(jié)果顯示，兩組IFN-γ、 IL-10分泌水平均呈現(xiàn)先升后降的趨勢，于24h達高峰。各時間段比較，實驗組IFN-γ濃度于24h時明顯高于對照組(p＜0.05)，其他時間段則無明顯差異。各時間段IL-10濃度均低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義，且IFN-γ/IL-10比值均高于對照組，差異明顯。同組內(nèi)各時間段IFN-γ/IL-10比

6、較，無明顯差異。3）成功構(gòu)建VVC小鼠模型。實驗組陰道灌洗液涂片中菌絲及孢子含量明顯低于對照組。實驗組灌洗液載菌量明顯低于對照組(p＜0.05)。ELISA結(jié)果顯示，實驗組IFN-γ濃度較對照組升高(p＜0.01)，IL-10濃度降低(p＜0.01)，IFN-γ/IL-10比值則明顯升高(p＜0.05)。
　　結(jié)論:1）成功構(gòu)建了LL-37的原核表達載體，并純化獲得具有抗真菌活性的重組蛋白。2）細胞及動物實驗均證實，重組LL-37