活性維生素D3及其受體對人系膜細胞中mTOR蛋白表達的影響.pdf

1、目的：探討活性維生素D3[1,25(OH)2D3]及其受體對體外培養(yǎng)的人腎小球系膜細胞增殖、細胞周期、凋亡及對人腎小球系膜細胞中mTOR蛋白表達的影響，初步探討1,25(OH)2D3及其受體通過PI3K/Akt/mTOR信號通路對人腎小球系膜細胞的調節(jié)作用。
　　方法：（1）體外培養(yǎng)人腎小球系膜細胞，隨機分為正常對照組、EGF(10ng/ml)組、1,25(OH)2D3（10-8mol/L）組、EGF聯(lián)合1,25(OH)2D3組，

2、通過倒置相差顯微鏡觀察各組干預48h后對人腎小球系膜細胞形態(tài)與生長的影響（2）采用CCK-8法檢測各組干預48h后對人腎小球系膜細胞增殖的影響（3）通過流式細胞術檢測各組干預48h后對人腎小球系膜細胞細胞周期的影響（4）TUNEL法檢測各組干預48h后對人腎小球系膜細胞細胞凋亡的影響（5）RT-PCR檢測各組干預48h后對人腎小球系膜細胞中mTORmRNA、nVDRmRNA表達的影響（6）采用western-blot法檢測各組干預48h

3、后人腎小球系膜細胞中mTOR、nVDR蛋白的表達情況。
　　結果：
　　(1)倒置相差顯微鏡下觀察人腎小球系膜細胞形態(tài)，正常對照組細胞胞體呈梭形，胞核居中，圓形或卵圓形，可見樹枝狀突起，部分突起相互融合成網(wǎng)格形；與正常對照組比較，EGF組細胞生長增快，細胞體積增大，細胞核增大，可見雙核細胞，1,25(OH)2D3組細胞的生長被顯著抑制，表現(xiàn)為細胞皺縮，體積變小，核濃縮成點狀，胞漿濃縮甚至出現(xiàn)空泡，EGF聯(lián)合1,25(OH)2

4、D3組細胞生長狀況欠佳，細胞呈梭形，細胞質的折光性欠佳，細胞核體積略小，胞質中可見少量空泡形成。
　?。?）CCK-8法檢測人腎小球系膜細胞增殖：與正常對照組相比，EGF組能顯著促進人腎小球系膜細胞的增殖，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），1,25(OH)2D3組能顯著抑制人腎小球系膜細胞增殖，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），EGF聯(lián)合1,25(OH)2D3組對人腎小球系膜細胞的增殖無明顯抑制或促進作用（P＞0.05）；與EGF

5、組相比，EGF聯(lián)合1,25(OH)2D3組均能顯著抑制人腎小球系膜細胞的增殖，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。
　?。?）流式細胞術檢測人腎小球系膜細胞細胞周期：與正常對照組相比，EGF組G1期細胞顯著減少，S期細胞顯著增多，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），1,25(OH)2D3組G1期細胞顯著增多，S期顯著減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），EGF聯(lián)合1,25(OH)2D3組G1期、S期細胞均無顯著性變化（P＞0.05）

6、；與EGF組相比，EGF聯(lián)合1,25(OH)2D3組G1期細胞顯著增多，S期細胞顯著減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。
　　(4)TUNEL法檢測人腎小球系膜細胞凋亡：與正常對照組相比，EGF組人腎小球系膜細胞的凋亡率顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），1,25(OH)2D3組人腎小球系膜細胞的凋亡率顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），EGF聯(lián)合1,25(OH)2D3組人腎小球系膜細胞凋亡率無顯著性變化（P＞

7、0.05）；與EGF組相比，EGF聯(lián)合1,25(OH)2D3組人腎小球系膜細胞凋亡率顯著增加（P＜0.01）。
　?。?）RT-PCR檢測人腎小球系膜細胞中mTORmRNA的表達：與正常對照組相比，EGF組人腎小球系膜細胞中mTORmRNA的表達顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），1,25(OH)2D3組人腎小球系膜細胞中mTORmRNA的表達顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），EGF聯(lián)合1,25(OH)2D3組人

8、腎小球系膜細中mTORmRNA的表達無顯著性變化（P＞0.05）；與EGF組相比，EGF聯(lián)合1,25(OH)2D3組人腎小球系膜細胞中mTORmRNA的表達顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；
　　(6)RT-PCR檢測人腎小球系膜細胞中nVDRmRNA的表達：各實驗組均未見nVDRmRNA的表達。
　　（7）western-blot檢測人腎小球系膜細胞中mTOR的表達：與正常對照組相比，EGF組人腎小球系膜細胞中m

9、TOR蛋白的表達顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），1,25(OH)2D3組人腎小球系膜細胞中mTOR蛋白的表達顯著減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），EGF聯(lián)合1,25(OH)2D3組人腎小球系膜細胞中mTOR蛋白的表達無顯著性變化（P＞0.05）；與EGF組比較，EGF聯(lián)合1,25(OH)2D3組人腎小球系膜細胞中mTOR蛋白的表達顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。
　　（8）western-blot檢測