腺病毒介導VEGF165基因預防移植靜脈再狹窄的研究.pdf

1、目的:攜帶免疫熒光的血管內皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor165, VEGF165)基因的復制缺陷性腺病毒( Adenovirus serotype5,Ad5)即 Ad5-VEGF165-CMV-EGFP在體外通過孵育的方法轉染靜脈橋然后再行血管旁路移植術,研究 VEGF165基因所表達的蛋白對自體移植靜脈內膜的影響。
　　方法:購買來的 Ad5-VEGF165-CMV-EGFP

2、在人胚腎293細胞上擴增到需要病毒數(shù)后經過氯化銫(caesium chloride, CSCL)梯度離心法純化。經過PCR鑒定腺病毒確實含有目的基因后冷凍備存。在自制血管支撐器輔助下行兔左側股動脈搭橋手術,橋血管采用股靜脈。實驗組股靜脈浸泡于含VEGF165腺病毒的溶液中(病毒滴度為1.0×109pfu/ml),對照組浸泡于鹽水中,對照組和實驗組都需37℃孵育30分鐘,溫鹽水沖洗備用。依次在術后2d、4d、6d、8d、10d、12d、1

3、4d、3w、4w、5w、6w、7w從實驗組和對照組中各處死一只實驗動物,對橋血管VEGF165基因行RT-PCR檢測。用測微尺測量實驗組和對照組的股靜脈的內膜的厚度,進行統(tǒng)計學分析。計算靜脈內膜的增生指數(shù),繪出股動脈搭橋術后時間—移植靜脈內膜增生曲線。還對移植靜脈進行HE和彈力纖維染色直接觀察內膜增生的組織學變化。
　　結果: Ad5-VEGF165-CMV-EGFP能夠在293細胞很好的擴增,轉染11天就可以收毒。經過三代擴增、

4、純化就能得到腺病毒顆粒數(shù)2.5×1011 VP/ml,滴度為1×1010 PFU/ml。在股動脈搭橋手術中用自制的血管支撐器會帶來很多便利,如對初學者來說提高吻合成功率、縮短手術時間約10分鐘。靜脈橋mRNA檢測得出術后兩天就有表達,一直可以持續(xù)的6周。HE染色和彈力纖維染色提示轉基因組移植靜脈的內膜增生較對照組小,但也增生。兩者結果經過Wilcoxon符號秩檢驗得出具有顯著性差異,有統(tǒng)計學意義。內膜增生指數(shù)也顯示對照組比轉基因組增生嚴