mCRT-vGPCR膜表達融合蛋白應用于腫瘤免疫治療的基礎研究.pdf

1、目的:用基因重組技術在病毒 G蛋白偶聯(lián)受體(vGPCR)N端融合小鼠鈣網(wǎng)蛋白(mCRT),獲得真核表達質粒 pcDNA3.1(+)-mCRT/vGPCR。將此質粒穩(wěn)定轉染至小鼠黑色素瘤細胞 B16-F1中,獲得膜上高表達融合蛋白 mCRT/vGPCR的B16-F1細胞株,然后體外檢測高表達融合蛋白的細胞被吞噬效應。用凋亡藥物處理這種細胞株后作為免疫原免疫 Balb/C小鼠,研究其激發(fā)機體抗腫瘤免疫應答的效用。本研究的目的在于探索抗腫瘤免

2、疫預防和治療的新途徑。
　　方法:(1)應用RT-PCR技術從小鼠黑色素瘤 B16-F1細胞總 RNA中克隆獲得含mCRT ORF全長序列的DNA片段。(2)從質粒 pSG5/vGPCR中克隆獲得 vGPCR ORF全長片段。(3)構建融合基因 mCRT/vGPCR并克隆入真核表達載體 pcDNA3.1(+)中。(4)用脂質體轉染法將重組質粒轉染至小鼠黑色素瘤 B16-F1細胞株中,用RT-PCR和Western blotting

3、檢測基因的表達,并用流式細胞術和細胞免疫熒光鑒定該融合蛋白在細胞膜上的定位。(5)直接將活的對照 B16-F1細胞、轉染 vGPCR的B16-F1細胞(B16-vGPCR)和轉染 mCRT/vGPCR的B16-F1細胞(B16-mCRT/vGPCR)接種于Balb/C小鼠皮下,觀察腫瘤生長情況。(6) MTT法檢測穩(wěn)定轉染質粒pcDNA3.1(+)-vGPCR和pcDNA3.1(+)-mCRT/vGPCR對 B16-F1細胞株生長的影響

4、。(7)多胺類似物(BENS)和蒽環(huán)類藥物(米托蒽醌)分別誘導小鼠黑色素瘤細胞B16-F1和B16-mCRT/vGPCR細胞株凋亡,經(jīng)皮下注射免疫 Balb/C小鼠,免疫8天后,用活的B16-F1皮下接種免疫后的Balb/C小鼠,觀察并紀錄腫瘤生長狀況。(8) ELISA法檢測小鼠血清中細胞因子的含量。
　　結果:(1)成功構建了重組真核表達質粒 pcDNA3.1(+)-mCRT/vGPCR, pcDNA3.1(+)-vGPCR。

5、(2)獲得膜穩(wěn)定表達融合蛋白的細胞株 B16-mCRT/vGPCR。(3)體外吞噬實驗表明,B16-F1細胞膜上高表達融合蛋白 mCRT/vGPCR可增強其被吞噬效應。(4)膜上高表達 mCRT的B16-F1細胞在小鼠體內生長受抑制,但體外 MTT檢測發(fā)現(xiàn) mCRT的高表達促進 B16-F1細胞的生長。(5)動物實驗表明,包被有融合蛋白mCRT/vGPCR的凋亡B16-F1細胞作為免疫原可刺激小鼠產生抗同種腫瘤的免疫效應。
　　結