轉錄激活因子3在肝細胞癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其相關機制研究.pdf

1、目的：檢測轉錄激活因子3（Activating Transcription Factor3,ATF3）在肝細胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）組織中的表達，結合臨床病理特征，探討ATF3與HCC發(fā)生發(fā)展的相關性；構建并制備過表達ATF3的慢病毒載體，觀察其介導的過表達ATF3對肝癌細胞株HepG2生物學行為的影響，闡明ATF3在HCC發(fā)生發(fā)展中的作用機制；篩選及驗證肝癌細胞中與ATF3相互結合的蛋白質，探討

2、在HCC發(fā)生發(fā)展過程中調控ATF3發(fā)揮生物學功能的分子機制。
　　方法：（1）應用RT-PCR，IHC和WB檢測并對比ATF3在肝癌標本及正常肝組織中的蛋白及基因水平，結合相關的臨床病理參數，探討ATF3與HCC形成的相關性；（2）構建并制備過表達ATF3的慢病毒載體，感染HepG2后進行MTT實驗，Transwell實驗，FCM檢測細胞周期及細胞凋亡，對比過表達前后細胞增殖、遷移能力、周期狀態(tài)及凋亡情況的變化，探討ATF3在HC

3、C發(fā)生發(fā)展中的作用及相關細胞學機制；（3）應用IP方法沉淀出Hep G2細胞中與ATF3相互結合的蛋白，并經變性聚丙烯凝膠分析，與陰性對照比對，挑選出差異性的電泳條帶并進行蛋白質譜分析，以篩選出ATF3可能的結合蛋白，再通過co-IP驗證二者是否相互結合。利用肝癌組織，結合IHC及WB檢測并分析ATF3和篩選出的蛋白質在HCC發(fā)生發(fā)展中的作用，探討二者的相互作用與HC C發(fā)生發(fā)展可能的分子機制。
　　結果：
　?。?）RT-

4、PCR相對定量檢測了53對HCC和10例正常肝組織中ATF3基因的水平，結果示ATF3在肝癌組織中的基因水平明顯低于遠癌肝組織及正常肝組織（P＜0.0001），遠癌肝組織與正常肝組織之間差異無顯著性（P＝0.6240）；臨床病理特征分組中，包膜侵犯的癌組織中ATF3基因水平低于無侵犯組（P＜0.05），而患者性別，腫瘤大小，脈管轉移，組織學分級，組織學類型，乙肝表面抗原狀態(tài)，AFP水平，BCLC分期，生存時間各分組中ATF3基因水平差異

5、無顯著性（P＞0.05）；
　?。?）IHC檢測了20對HCC和10例正常肝組織中ATF3蛋白的表達，結果示ATF3蛋白定于細胞核內，陽性表達呈核內棕褐色彌漫性表達，在肝癌組織中的染色弱于遠癌肝組織及正常肝組織；
　?。?）WB相對定量檢測了53對HCC和10例正常肝組織中ATF3蛋白的水平，結果示ATF3在肝癌組織中的蛋白水平明顯低于遠癌肝組織及正常肝組織（P＜0.05），遠癌肝組織與正常肝組織之間差異無顯著性（P＝0.3

6、260）；臨床病理特征分組中，包膜侵犯的癌組織中ATF3蛋白水平低于無侵犯組（P＜0.05），而患者性別，腫瘤大小，脈管轉移，組織學分級，組織學類型，乙肝表面抗原狀態(tài)，AFP水平，BCLC分期，生存時間各分組中ATF3蛋白水平差異無顯著性（P＞0.05）；
　?。?）成功構建過表達ATF3的慢病毒載體，進行慢病毒包裝及滴度測定后，感染肝癌細胞株HepG2，隨即進行MTT實驗，Transwell實驗，細胞周期及細胞凋亡檢測，結果顯示

7、過表達ATF3的HepG2細胞出現了增殖速度減慢，細胞凋亡加速，生長周期阻滯（P＜0.05），而細胞遷移能力改變不明顯（P＝0.262）；
　?。?）將過表達ATF3的Hep G2細胞及空載體感染的Hep G2細胞同時進行IP，以空載體組為對照，檢測出過表達組中表達水平呈現差異性的電泳條帶數條，送檢蛋白質譜分析；
　?。?）蛋白質譜分析后檢測出可能與ATF3存在相互結合關系的候選蛋白，經Mas cot軟件分析及NCBI數據庫

8、檢索，得到候選蛋白肽段序列等信息，結合實驗結果，Pumbed文獻，從功能明確的候選蛋白質中，篩選出與ATF3最可能相關的結合蛋白Gelsolin（GSN）。
　?。?）應用co-IP技術，驗證了ATF3和GSN之間存在相互結合關系，通過IHC及WB檢測出HCC組織切片中ATF3及其相互結合蛋白GSN的表達模式一致；通過功能已明確的GSN蛋白及其與ATF3之間的相關性推測出ATF3在肝癌形成過程中發(fā)揮其作用的可能分子機制。
　

9、　結論：
　?。?）肝癌組織中的ATF3基因及蛋白表達水平低于遠癌及正常肝組織，包膜受侵犯組織中的ATF3表達水平低于包膜無侵犯組織，推測ATF3在肝癌形成過程中扮演著抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的角色；
　　（2）過表達ATF3的HepG2細胞株出現了增殖速度減慢，細胞凋亡加速及生長周期阻滯，細胞遷移能力有減弱趨勢，推測ATF3通過抑制腫瘤細胞增長，加速腫瘤細胞凋亡及阻滯細胞周期進程的生物學行為發(fā)揮其抑制肝癌形成的作用；
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