P-gp參與耐藥乳腺癌細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　越來(lái)越多的證據(jù)表明在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，耐藥和轉(zhuǎn)移的發(fā)生可能不是兩個(gè)孤立的過(guò)程，兩者之間存在一種功能上的聯(lián)系。前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)應(yīng)用RNA干擾技術(shù)降低Anxa2的表達(dá)量后耐藥乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力明顯降低。說(shuō)明Anxa2表達(dá)升高可能是耐藥乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)的重要原因。眾所周知，腫瘤耐藥的發(fā)生80％是由P-glycoprotein(P-gp)介導(dǎo)的。我們實(shí)驗(yàn)室前期實(shí)驗(yàn)表明在乳腺癌耐藥細(xì)胞中，Anxa2的表達(dá)隨著MDR1的升

2、高而同步升高，免疫熒光檢測(cè)也證實(shí)兩種蛋白之間存在良好的共定位，我們推測(cè)P-glycoprotein和Anxa2的相互作用促進(jìn)耐藥乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。本研究應(yīng)用免疫共沉淀、免疫熒光、Westrenblotting、ShRNA等多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)，研究P-glycoprotein的表達(dá)和活性改變對(duì)Anxa2的表達(dá)和酪氨酸磷酸化的影響，并深入探討這種協(xié)同作用促進(jìn)耐藥腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的分子機(jī)制。
　　方法：
　　1.采用RNA干擾技術(shù)使人多

3、藥耐藥乳腺癌MCF-7/ADR細(xì)胞中P-glycoprotein蛋白的表達(dá)水平下降，并用Westren blotting技術(shù)驗(yàn)證其表達(dá)水平。
　　2.應(yīng)用噻唑藍(lán)(MTT)比色法實(shí)驗(yàn)檢測(cè)P-glycoprotein降表達(dá)對(duì)MCF-7/ADR細(xì)胞增殖能力的影響，以及細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性。
　　3.流式細(xì)胞術(shù)用來(lái)檢測(cè)P-glycoprotein抑制劑是否對(duì)P-glycoprotein泵的活性有效。
　　4.應(yīng)用體外遷移和侵襲

4、實(shí)驗(yàn)檢測(cè)P-glycoprotein表達(dá)水平下降后對(duì)多藥耐藥乳腺癌細(xì)胞MCF-7/ADR體外遷移和侵襲能力的影響。
　　5.免疫共沉淀技術(shù)用來(lái)檢測(cè)P-glycoprotein和Anxa2的相互作用，同時(shí)采用免疫熒光技術(shù)來(lái)觀察二者在細(xì)胞內(nèi)的共定位情況，再結(jié)合劃痕實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步分析二者對(duì)細(xì)胞遷移的影響。
　　6.應(yīng)用Westren blotting和免疫共沉淀技術(shù)來(lái)研究ERK1/2信號(hào)通路和Anxa2的酪氨酸磷酸化的變化，從而探討這

5、種協(xié)同作用促進(jìn)耐藥腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)的分子機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　1.應(yīng)用RNA干擾技術(shù)，按照轉(zhuǎn)染試劑的說(shuō)明書轉(zhuǎn)染MCF-7/ADR細(xì)胞后，篩選到三株穩(wěn)定的P-glycoprotein降表達(dá)的單克隆細(xì)胞。
　　2.P-glycoprotein降低表達(dá)后MCF-7/ADR的增殖能力無(wú)明顯改變，但其耐藥能力都有明顯的下降。
　　3.體外侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明P-glycoprotein蛋白表達(dá)水平下降后MCF-7/AD

6、R的遷移和侵襲能力明顯被抑制。
　　4.免疫共沉淀技術(shù)發(fā)現(xiàn)P-glycoprotein和Anxa2在MCF-7/ADR細(xì)胞中存在相互作用，應(yīng)用免疫熒光技術(shù)發(fā)現(xiàn)二者在細(xì)胞膜上存在良好的共定位。劃痕實(shí)驗(yàn)也表明二者共定位于劃痕邊緣的細(xì)胞膜上。
　　5.Westren blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在MCF-7/ADR細(xì)胞中無(wú)論是降低P-glycoprotein的表達(dá)還是抑制其活性，都影響了阿霉素誘導(dǎo)的ERK1/2的磷酸化。
　

7、　6.免疫共沉淀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)P-glycoprotein能調(diào)節(jié)Anxa2的酪氨酸磷酸化水平。
　　結(jié)論：
　　1.在多藥耐藥MCF-7/ADR細(xì)胞中，P-glycoprotein和Anxa2存在相互作用并且在細(xì)胞膜上存在良好的共定位。
　　2.P-glycoprotein表達(dá)水平降低和抑制其活性后，MCF-7/ADR細(xì)胞的遷移能力明顯下降，體外侵襲能力也明顯減弱。
　　3.進(jìn)一步的機(jī)制研究結(jié)果顯示：在多藥耐藥乳腺癌細(xì)