5-氮胞苷體外誘導人臍帶間質干細胞心肌樣分化及機制研究.pdf

1、目的：探討5-氮胞苷誘導人臍帶間質干細胞(human umbilical cordmesenchyrmal stem cells,hucMSCs)體外向心肌樣細胞分化的生物學特點,并初步揭示誘導分化的可能機制。
　　 方法：采用組織塊貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)hucMSCs。體外經5-氮胞苷(5-Azacytidine,5-Aza)誘導第2代hucMSCs向心肌樣分化；通過透射電鏡、RT-PCR、免疫組化、實時熒光定量RT-PCR及We

2、stern blot等方法鑒定心肌樣細胞的超微結構,心肌特異性基因及蛋白表達,干細胞標志變化等。采用Western blot方法分析誘導分化過程中ERK及PKC相關信號分子通路的變化并用相應抑制劑阻斷信號分子通路,進一步觀察5-Aza誘導后hucMSCs中基因及蛋白的表達變化。
　　 結果：經5-Aza體外誘導hucMSCs向心肌樣細胞分化,RT-PCR顯示誘導組細胞結蛋白(desmin)表達顯著增加并表達心肌特異性標志如β-肌

3、球蛋白重鏈(β-myosin heavy chain)、心肌鈣蛋白T(cardiac troponinT)、心鈉素(A—type natriuretic peptide)、Nkx2.5,免疫組化呈結蛋白、心肌鈣蛋白強陽性；在透射電鏡下,誘導后細胞具有條索狀肌絲形成。實時熒光定量RT—PCR及Western blot顯示干細胞標志物Nanog、Oct4、Sox2、Sall4在5-Aza誘導后的hucMSCs中mRNA及蛋白水平均顯著下降。

4、隨誘導時間延長,誘導后hucMSCs中ERK磷酸化水平逐漸增加,而PKC無明顯變化。使用MEK通路抑制劑U0126作用后,誘導后hucMSCs產生的相關心肌特異性基因及蛋白表達顯著減少,且STAT3磷酸化水平及MEF-2c、MyoD的蛋白表達明顯受到抑制。5-Aza誘導人肺成纖維細胞(human diploid lung fibroblasts,HFL1)兩周后不表達心肌相關及特異性基因,且5-Aza不能誘導hucMSCs向成骨細胞分化