重組腺病毒攜帶p53聯(lián)合抗癌藥物對(duì)間皮瘤的抗腫瘤效果研究.pdf

1、目的:惡性胸膜間皮瘤(malignant pleural mesothelioma,MPM)是一種源于胸膜間皮細(xì)胞、以局部侵襲為主、惡性度較高的罕見疾病。大多數(shù)惡性間皮瘤由石棉類物質(zhì)的過(guò)多接觸引起。盡管現(xiàn)在有很多治療手段,但仍然是一個(gè)棘手的病癥。它的潛伏期很長(zhǎng),目前也沒(méi)有可行的預(yù)防手段。未來(lái)數(shù)十年中,在很多工業(yè)化國(guó)家及新興發(fā)展中國(guó)家中病人的數(shù)量會(huì)持續(xù)攀升。胸膜切除術(shù)是一個(gè)僅適用于早期患者的治療選擇,但根治術(shù)后仍經(jīng)常復(fù)發(fā)。間皮瘤對(duì)放射治療

2、拮抗,因此僅在姑息療法時(shí)使用。因此對(duì)大多數(shù)患者來(lái)說(shuō)化學(xué)療法是首選,聯(lián)合使用順鉑(CDDP)和培美曲塞(PEM)是目前一線的治療方案。然而,聯(lián)合順鉑和培美曲塞的治療方案平均生存期僅為12.1個(gè)月,且預(yù)后差。因此需要有一個(gè)新的治療方案來(lái)提高病人的預(yù)后和生活質(zhì)量。
　　 大多數(shù)惡性間皮瘤含有野生型P53基因,但p14ARF、p16INK4A基因缺陷。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)強(qiáng)制表達(dá)p53(Ad-p53):以腺病毒為載體,p53為治療基因,檢測(cè)是否會(huì)

3、抑制間皮瘤細(xì)胞的生長(zhǎng),以及Ad-p53與順鉑或培美曲塞聯(lián)用是否產(chǎn)生抗腫瘤效果。結(jié)果顯示Ad-p53進(jìn)行間皮瘤轉(zhuǎn)導(dǎo),誘導(dǎo)P53磷酸化,從而上調(diào)p21和下調(diào)phos-Rb表達(dá)水平,并引起細(xì)胞凋亡蛋白酶8(caspase-8)和3(caspase-3)的剪切,從而引起癌細(xì)胞凋亡;細(xì)胞周期分析顯示出增加的G0/G1期比例以及sub-G1期比例,主要取決于細(xì)胞類型和Ad-p53的劑量;體外實(shí)驗(yàn)Ad-p53轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制了間皮瘤細(xì)胞活性并以協(xié)同的方式,增

4、強(qiáng)了順鉑或培美曲塞的抑制效應(yīng);胸腔內(nèi)注射Ad-p53和順鉑全身給藥在原位動(dòng)物模型產(chǎn)生出抗腫瘤效果。這些數(shù)據(jù)共同表明腺病毒攜帶P53基因(Ad-p53)是一種可以與一線藥物聯(lián)合治療間皮瘤的方法。
　　 方法:
　　 本研究選用人體間皮瘤細(xì)胞系,NCI-H2452,NCI-H2052,NCI-H226,NCI-Ft28及MSTO-211H。通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn),檢測(cè)Ad-p53的轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)此5種間皮瘤細(xì)胞系的增殖抑制效果。使用流式細(xì)胞

5、周期分析方法檢測(cè)Ad-p53對(duì)細(xì)胞周期變化的影響。以Western blot方法研究Ad-p53轉(zhuǎn)導(dǎo)引起的細(xì)胞凋亡傳導(dǎo)通路。MTT實(shí)驗(yàn),檢測(cè)Ad-p53和CDDP或PEM聯(lián)合用藥產(chǎn)生協(xié)同的癌細(xì)胞抑制作用。最后又運(yùn)用動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn),檢測(cè)Ad-p53和CDDP的聯(lián)合抗腫瘤效果。
　　 結(jié)果:
　　 1：MTT分析結(jié)果
　　 Ad-p53基因治療,除了NCI-H2052細(xì)胞外,以劑量依賴方式抑制了NCI-H28、NCI-

6、H2452、NCI-H226和MSTO-211H間皮瘤細(xì)胞的生長(zhǎng),而對(duì)照組Ad-LacZ則未抑制間皮瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。50％抑制濃度值(IC50)顯示NCI-H28細(xì)胞對(duì)Ad-p53最敏感,隨后是NCI-H2452細(xì)胞,而NCI-H226和MSTO-211H細(xì)胞敏感程度相似。NCI-H2052細(xì)胞對(duì)Ad-p53不敏感,部分原因可能是Ad受體的低表達(dá)水平。
　　 2：流式細(xì)胞周期分析結(jié)果
　　 Ad-p53感染間皮瘤細(xì)胞系MS

7、TO-211H和NCI-H28。Ad-p53誘導(dǎo)了MSTO-211H細(xì)胞G0/G1期的靜止和sub-G1的增加;而Ad-p53感染NCI-H28細(xì)胞后顯現(xiàn)出G2/M期比例增加,S期比例下降,及明顯的sub-G1的增加。與MSTO-211H細(xì)胞相比,NCI-H28細(xì)胞的sub-G1增加的更為顯著,顯示出NCI-H28細(xì)胞對(duì)Ad-p53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具有更高的敏感性。
　　 3：蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果
　　 3.1：蛋白質(zhì)印跡分

8、析法檢測(cè)了在MESO-211H和NCI-H28細(xì)胞中Ad-p53介導(dǎo)的分子傳導(dǎo)通路。Ad-p53誘導(dǎo)P53磷酸化及P21表達(dá)水平的增加。Phos-Rb的下調(diào),相當(dāng)于從磷酸化狀態(tài)到非磷酸化狀態(tài)的轉(zhuǎn)換。以上數(shù)據(jù)共同表明Ad-p53激活了p53介導(dǎo)的分子傳導(dǎo)通路;
　　 3.2：在MSTO-211H和NIC-H28兩個(gè)細(xì)胞系中,Ad-p53轉(zhuǎn)導(dǎo)后誘發(fā)了caspase-3和caspase-8的剪切,卻沒(méi)有誘導(dǎo)caspase-9的剪切。B

9、id表達(dá)水平保持不變,t-Bid在兩種細(xì)胞中均未檢測(cè)到。這些數(shù)據(jù)共同表明Ad-p53轉(zhuǎn)導(dǎo)通過(guò)caspase-8激活了的死亡受體介導(dǎo)的外源性凋亡通路,但通過(guò)caspase-9線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡通路卻很可能未被涉及。
　　 4：MTT分析Ad-p53與抗腫瘤藥物的聯(lián)合協(xié)同作用
　　 4.1：MSTO-211H和NIC-H28細(xì)胞用不同濃度的CDDP作用后,再進(jìn)行Ad-p53轉(zhuǎn)導(dǎo)。結(jié)果顯示Ad-p53誘導(dǎo)增強(qiáng)了CDDP產(chǎn)生

10、的抗腫瘤效果,CalcuSyn軟件分析顯示Ad-p53和CDDP聯(lián)合應(yīng)用產(chǎn)生協(xié)同的癌細(xì)胞抑制作用。
　　 4.2：MSTO-211H和NIC-H28細(xì)胞用不同濃度的PEM作用后,再進(jìn)行Ad-p53轉(zhuǎn)導(dǎo)。結(jié)果顯示Ad-p53誘導(dǎo)增強(qiáng)了PEM產(chǎn)生的抗腫瘤效果,CalcuSyn軟件分析顯示Ad-p53和PEM聯(lián)合應(yīng)用產(chǎn)生協(xié)同的癌細(xì)胞抑制作用。
　　 5：體內(nèi)抗腫瘤試驗(yàn)結(jié)果
　　 間皮瘤細(xì)胞系(MSTO-211H)通過(guò)胸

11、腔注射到免疫缺陷老鼠的胸腔內(nèi),從而擴(kuò)大其胸膜內(nèi)擴(kuò)散轉(zhuǎn)移。給裸鼠胸腔內(nèi)注射Ad-p53,Ad-LacZ作為對(duì)照。28天的腫瘤重量顯示Ad-p53產(chǎn)生出抗腫瘤效果,而對(duì)照組Ad-LacZ治療卻沒(méi)能影響腫瘤重量。Ad-p53和CDDP給藥中,兩者均能單獨(dú)抑制腫瘤生長(zhǎng),但兩者聯(lián)用產(chǎn)生的抑制腫瘤能力大大優(yōu)于單用Ad-p53或單用CDDP。
　　 結(jié)論:
　　 1：Ad-p53以劑量依賴性的方式抑制了間皮瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。
　　

12、 2：Ad-p53誘導(dǎo)間皮瘤細(xì)胞周期變化,從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。
　　 3：Ad-p53激活了p53介導(dǎo)的分子傳導(dǎo)通路及外源性細(xì)胞凋亡通路。
　　 4：Ad-p53增強(qiáng)了抗腫瘤試劑的細(xì)胞毒性。
　　 5：Ad-p53和順鉑聯(lián)用產(chǎn)生協(xié)同的體內(nèi)抗腫瘤效果。
　　 綜上所述,Ad-p53轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制了間皮瘤細(xì)胞活性并以協(xié)同的方式增強(qiáng)了順鉑或培美曲塞的細(xì)胞增殖抑制效應(yīng),胸腔內(nèi)注射Ad-p53和順鉑全身給藥在原位動(dòng)物模型產(chǎn)