捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)精氨酸激酶的克隆表達(dá)及其抗原特性分析.pdf

1、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)屬于圓線目(Strongylata)，毛圓科(Trichostrongylidae)，血矛屬(Haemonchus)，主要寄生在反芻獸的第四胃，偶見(jiàn)于小腸，以吸食宿主動(dòng)物的血液為生，導(dǎo)致宿主貧血和引發(fā)貧血綜合癥，嚴(yán)重的可致動(dòng)物、特別是幼畜的大批量死亡，致使畜牧養(yǎng)殖業(yè)蒙受巨大損失。目前，主要靠化學(xué)藥物控制捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)病，但是化學(xué)藥物的濫用已導(dǎo)致捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)抗藥蟲(chóng)株在世界范圍內(nèi)出現(xiàn)，不僅污染環(huán)境，而且殘存化學(xué)藥物的農(nóng)畜產(chǎn)品流入市

2、場(chǎng)也會(huì)嚴(yán)重影響人類的身體健康。因此尋找符合時(shí)代要求的新的防控捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)病方法已迫在眉睫。
　　當(dāng)今，對(duì)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)的免疫學(xué)研究已經(jīng)取得重大進(jìn)展，但仍無(wú)商品化的疫苗上市。因此發(fā)掘新的抗原及深入研究該蟲(chóng)體抗原的特性對(duì)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)病的防控具有重要意義。本文對(duì)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)的精氨酸激酶進(jìn)行基因克隆、表達(dá)與純化，并對(duì)重組蛋白的酶活性進(jìn)行分析;研究了該重組蛋白對(duì)山羊外周單核細(xì)胞各細(xì)胞因子mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響及對(duì)外周血單核細(xì)胞的增殖作用;分析

3、了精氨酸激酶在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)雌、雄蟲(chóng)體內(nèi)的分布情況。
　　1、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)精氨酸激酶基因的克隆與表達(dá)
　　根據(jù)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)精氨酸激酶(Arginine Kinase，AK)基因序列設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，用RT-PCR方法從捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)總RNA中擴(kuò)增出約為1104 bp的DNA片段。將該片段克隆到pMD19-T載體后進(jìn)行序列測(cè)定和分析，發(fā)現(xiàn)該基因與GenBank中捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)AK基因的相似度為99％。將該基因的開(kāi)放閱讀框克隆到pE

4、T-32a(+)載體中，獲得原核表達(dá)質(zhì)粒pET32/AK，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，重組子用IPTG誘導(dǎo)，經(jīng)SDS-PAGE分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該基因獲得了表達(dá)，重組蛋白分子量大小約為60.3 KD，重組蛋白主要以包涵體形式存在。對(duì)該包涵體蛋白變性、純化后，用梯度尿素對(duì)其進(jìn)行連續(xù)透析復(fù)性后，Western blot分析顯示該重組蛋白可被人工感染捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)山羊的血清所識(shí)別。
　　2、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)精氨酸激酶的酶活性測(cè)定
　　為了解捻轉(zhuǎn)

5、血矛線蟲(chóng)精氨酸激酶的催化特性，進(jìn)而為其成為有效藥物靶標(biāo)奠定基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)采用改進(jìn)的定磷法對(duì)原核表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行精氨酸激酶酶活性測(cè)定，選用10、20、25、30、35、40、50和60℃8個(gè)溫度點(diǎn)和5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0和10.0共8個(gè)pH點(diǎn)進(jìn)行酶的催化反應(yīng)，分光光度計(jì)于660nm處測(cè)反應(yīng)體系的吸光度，根據(jù)磷含量和酶活性定義計(jì)算其酶活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該重組蛋白具有一定的酶活性，其最佳反應(yīng)溫度和pH分別為30℃

6、和pH7.5。
　　3、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)重組AK蛋白對(duì)山羊外周單核細(xì)胞細(xì)胞因子表達(dá)情況的影響
　　用0、10、20、40μg/mL四種不同濃度的重組AK蛋白分別刺激山羊外周血單核細(xì)胞，37℃共培養(yǎng)24 h后，收集培養(yǎng)細(xì)胞并提取其總RNA，采用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組中IL-2、IL-4、IL-10、IL-17、IFN-γ和TGF-β mRNA轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示，在重組AK濃度為40μg/mL組中IL-17 mRNA轉(zhuǎn)錄水平

7、是對(duì)照組(空pET-32a(+)蛋白組）的9.45倍，在20μg/mL組中其為對(duì)照組的2.69倍;IFN-γ的mRNA轉(zhuǎn)錄水平在10、20、40μg/mL三個(gè)實(shí)驗(yàn)組中分別是對(duì)照組的2.20、3.15、4.14倍。而IL-2、IL-4、IL-10和TGF—β變化不顯著。
　　4、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)重組AK蛋白對(duì)山羊外周單核細(xì)胞的增殖作用
　　為檢測(cè)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)重組AK蛋白對(duì)山羊外周血單核細(xì)胞的刺激與增殖作用，將0、10、20、40μ

8、g/mL四個(gè)不同濃度的重組蛋白與山羊外周血單核細(xì)胞37℃共同培養(yǎng)24 h后，用CCK-8試劑盒檢測(cè)其增殖效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組AK在添加濃度為10tg/mL和20μg/mL時(shí)增殖效果顯著，其增殖指數(shù)分別為1.68和1.39;而pET-32a(+)空載體蛋白刺激增殖效果不顯著，其增殖指數(shù)為0.95，這說(shuō)明AK有促進(jìn)山羊外周血單核細(xì)胞增殖的效果。
　　5、精氨酸激酶在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)雌、雄成蟲(chóng)中的定位
　　為研究捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)AK在捻轉(zhuǎn)血