新型納米復合載體的構(gòu)建及其介導NK4基因在治療乳腺癌中的應用.pdf

1、前言
　　 隨著醫(yī)學分子生物學研究的深入和應用,基因治療逐漸成為腫瘤生物治療學中的重要組成部分,在乳腺癌的治療中顯示出良好的應用前景。目前,乳腺癌基因治療尚存在一些問題,首先,用于研究和應用臨床的基因轉(zhuǎn)染方法有多種,但轉(zhuǎn)染效果仍不令人滿意。例如,逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染率較高且表達穩(wěn)定,但它僅對增殖活躍的細胞才有較高的轉(zhuǎn)染率,且在轉(zhuǎn)染過程中可整合到宿主細胞而發(fā)生插入型突變和癌基因激活,不適于介導人體內(nèi)基因的轉(zhuǎn)移。腺病毒所攜帶的基因雖具有較

2、高的轉(zhuǎn)染率但不能整合到宿主細胞的染色體上,不能長期穩(wěn)定表達,轉(zhuǎn)染靶細胞后會產(chǎn)生免疫反應。而且,乳腺癌基因治療缺乏特異性和高效性載體,若僅部分腫瘤細胞被導入基因,治療效果會受到影響,而載體特異性差則會導致癌旁組織及骨髓等其他重要組織被累及。因此,加強基因治療的靶向性、安全性,開發(fā)出高效的新載體系統(tǒng)已成為該領(lǐng)域研究的熱點。
　　 陽離子高分子聚合物聚乙烯亞胺(polyethylenimine,PEI)因其能有效濃縮DNA分子形成穩(wěn)定

3、的納米粒子,保護DNA分子的生物活性、避免酶解、并能被細胞有效內(nèi)吞,從而在細胞內(nèi)實現(xiàn)DNA分子的解離釋放和表達,已成為非病毒陽離子聚合物載體中最成功的例子,是設計新的陽離子聚合物轉(zhuǎn)染載體的標準。當前研究主要從降低細胞毒性,提高轉(zhuǎn)染效率及細胞靶向性等方面對PEI進行改造。最吸引人的策略之一是利用受體介導的細胞內(nèi)吞作用來替代PEI和細胞間的非特異靜電作用,這種主動的靶向需要使用高親和性和特異性的配體識別結(jié)合部位的靶細胞表面的受體。透明質(zhì)酸(

4、hyaluronic acid,HA),作為抗腫瘤藥物的靶向載體,能夠?qū)⑤^小的藥物分子黏附在它的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中或者將藥物分子接枝到透明質(zhì)酸類藥物的載體上,所形成的粒子或復合物與腫瘤細胞表面的受體靶向結(jié)合,使更多的藥物分子進入腫瘤組織,增加抗腫瘤藥在腫瘤和淋巴結(jié)中的吸收和滯留時間,從而提高藥物的療效,降低毒副作用。本實驗將HA作為靶向配體修飾PEI/DNA復合物,構(gòu)建HA/PEI/DNA三元納米復合物,并對其進行表征和性能檢測。
　　

5、 由于乳腺癌的基因治療缺乏更為有效的目的基因,NK4作為HGF的拮抗劑,具有血管新生抑制和癌浸潤抑制兩大作用,這種雙重作用在裸鼠乳腺癌移植試驗上已獲得了證實,即提示它可成為具備這兩大功能的嶄新抗癌藥。因此本實驗采用NK4為目的基因,首次構(gòu)建HA/PEI/PCAGGS-NK4納米復合物,考察其在體外對乳腺癌細胞的作用,并建立裸鼠乳腺癌移植瘤模型,觀察三元復合物HA/PEI/PCAGGS-NK4在體內(nèi)的抑瘤效果。
　　 實驗方法

6、r>　　 一、HA/PEI/DNA三元納米復合物的構(gòu)建及性能檢測
　　 1、HA/PEI/DNA三元復合物的構(gòu)建與表征
　　 制備不同HA與PEI負正電荷摩爾比的。HA/PEI/DNA三元復合物,瓊脂糖凝膠電泳進行DNA凝膠阻滯實驗,馬爾文粒度分析儀檢測納米粒的粒徑分布及Zeta電位,比較其在水及BSA中的粒徑變化。
　　 2、HA/PEI/DNA三元復合物的體外細胞轉(zhuǎn)染實驗
　　 取乳腺癌細胞MDA-

7、MB-231,MCF-7,MDA-MB-435,轉(zhuǎn)染一定量上述不同電荷比的納米復合物,在流式細胞儀中檢測轉(zhuǎn)染率。
　　 3、乳腺癌細胞系CD44表達水平
　　 三種乳腺癌細胞用無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)。收集細胞的培養(yǎng)上清,細胞抽提物總蛋白采用BCA蛋白分析試劑盒定量。SDS-PAGE電泳后,轉(zhuǎn)膜,加CD44s單克隆抗體孵育后,加入辣根過氧化物酶標記的兔抗鼠二抗,顯色,以β-actin為內(nèi)標。
　　 4、三元復合物對COS

8、-1細胞的毒性試驗
　　 對數(shù)生長期的COS-1細胞,加入不同濃度的不同HA與PEI電荷比的三元復合物,繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,加MTT液振搖,孵育4h后加入DMSO,裂解細胞,混勻,選擇570nm波長,用酶標儀測定各孔光吸收值。
　　 二、HA/PEI/PCAGGS-NK4納米復合物對乳腺癌細胞作用的研究
　　 1、HA/PEI/PCAGGS-NK4納米粒的制備與表征
　　 制備納米粒HA/PEI/PCAG

9、GS-NK4與HA/PEI/PCAGGS-LacZ,進行DNA凝膠阻滯實驗,測定粒徑和Zeta電位,方法均同上述三元復合物的構(gòu)建與表征方法。
　　 2、Western-blot檢測乳腺癌細胞NK4蛋白的表達
　　 MDA-MB-231,MDA-MB-435,MCF-7細胞,加入用無血清培養(yǎng)基稀釋含100μg/ml PCAGGS-NK4質(zhì)粒的納米復合物,4h后加入含有血清的培養(yǎng)基培養(yǎng),回收各組細胞加入細胞裂解液,刮取細胞裂

10、解物,進行SDS-PAGE分離蛋白條帶,轉(zhuǎn)膜后,加入NK4一抗(人HGF單抗)孵育,再加入辣根過氧化物酶標記的二抗,β-actin做對照。
　　 3、MTT法測定細胞增殖能力
　　 三種乳腺癌細胞過夜貼壁后,換液加入無血清培養(yǎng)基稀釋的不同濃度HA/PEI/PCAGGS-NK4與HA/PEI/PCAGGS-LacZ納米復合物,繪制細胞生長曲線,比較各組細胞的增殖能力。
　　 4、Transwell法測定癌細胞侵襲能

11、力
　　 細胞貼壁后換液加入用無血清培養(yǎng)基稀釋的含不同濃度PCAGGS-LacZ,PCAGGS-NK4質(zhì)粒的納米復合物,12h后用胰酶消化,接種于Transwell小室的上室,其下室中加入含10％新生小牛血清的培養(yǎng)液,12h后取出小室,固定,染色,高倍光鏡下計數(shù)5個不同視野的穿過膜的細胞數(shù)。
　　 5、流式細胞儀分析細胞凋亡率
　　 將被染色分析的細胞用冷PBS洗滌二次并在恰當?shù)娜旧彌_液中重懸。吸取100ul的

12、細胞(1×105)至試管中。加入適量的熒光標記的Annexin Ⅴ試劑和PI,混勻后避光室溫下孵育15min后加入400ul染色緩沖液,立即上流式細胞儀分析。取少量滴片,置熒光鏡下觀察細胞凋亡形態(tài),計算凋亡、壞死百分率。
　　 三、HA/PEI/PCAGGS-NK4對裸鼠移植瘤生長抑制作用的考察
　　 1、建立人乳腺癌細胞裸鼠移植瘤模型與給藥
　　 BALB/c(nu/nu)裸鼠30只,每只接種0.2ml(1×1

13、07/ml MDA-MB-231)細胞于裸鼠右側(cè)胸壁第二乳頭下脂肪墊內(nèi)。8d后,隨機分為3組,每組10只,分別命名為:(1)對照組,即HA/PEI/PCAGGS-LacZ注射組(腫瘤及腫瘤周圍多點注射200 μl質(zhì)粒溶液,含100μg PCAGGS-LacZ)；(2)給藥組,即HA/PEUPCAGGS-NK4注射組(腫瘤及腫瘤周圍多點注射200 μl質(zhì)粒溶液,含100μg PCAGGS-NK4)；(3)陽性對照組,即阿霉素組,0.2ml

14、(含阿霉素100μg)腹腔注射,繪制腫瘤生長曲線,抑瘤率=(1-處理組平均瘤重/對照組平均瘤重)×100％。
　　 2、Western blot檢測移植瘤細胞NK4蛋白的表達
　　 稱取于液氮中保存的組織0.2g,以預冷的PBS洗3次并用眼科剪將組織剪碎,在10倍于其體積的裂解緩沖液中迅速攪成勻漿,4℃離心10min,吸出上清液為細胞總蛋白,用Bradford法測蛋白濃度。經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜,再用含5％脫脂奶粉

15、的TBST液封閉,然后加入一抗、二抗孵育,用ECL發(fā)光法檢測不同樣品NK4蛋白表達狀況。
　　 四、統(tǒng)計學分析
　　 采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件處理,計量資料以均數(shù)±標準差((x)±s)表示,采用one-way ANOVA分析,組間比較采用LSD檢驗P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié) 論
　　 1、所構(gòu)建的HA/PEI/DNA能有效結(jié)合DNA分子,在BSA中不會引起聚集。HA的加入使納米復合物在

16、三種乳腺癌細胞中的轉(zhuǎn)染效率均有增加,在MDA-MB-231,MDA-MB-435(高CD44S表達的)兩種細胞中轉(zhuǎn)染率明顯升高,產(chǎn)生了細胞靶向性,當HA與PEI電荷比為7.5％時,HA/PEI/DNA在三種細胞中的轉(zhuǎn)染率最高。三元復合物對COS-1細胞的毒性相對于PEI/DNA二元復合物大大降低,幾乎無毒。
　　 2、HA/PEI/PCAGGS-LacZ及HA/PEUPCAGGS-NK4三元復合物在BSA中不會引起聚集,質(zhì)粒的結(jié)

17、構(gòu)并不影響納米粒的粒徑及Zeta電位等物理性質(zhì)。三種乳腺癌細胞系被HA/PEI/PCAGGS-NK4轉(zhuǎn)染后,表達了NK4外源蛋白,隨著轉(zhuǎn)染復合物濃度的增加,細胞增殖有逐漸受到抑制的趨勢,細胞的侵襲遷移力均有不同程度的減弱,凋亡百分率均有不同程度的增加。差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　 3、成功建立人乳腺癌細胞裸鼠移植瘤模型,陽性對照組(阿霉素組)和給藥組(HA/PEI/PCAGGS-NK4三元復合物組)裸鼠瘤體的增長均