人CD160基因轉染細胞株的構建及其單克隆抗體的研制.pdf

1、CD160分子是糖基磷脂酰肌醇錨定蛋白，是免疫超家族成員，與其特異性配體HVEM分子結合所提供的共刺激信號在T細胞的增殖，活化，細胞因子產生和B細胞增殖，活化，分泌抗體產生等方面發(fā)揮著重要的調節(jié)作用。CD160分子作為一個負向抑制信號，參與眾多免疫過程。建立L929/CD160基因轉染細胞株和鼠抗人CD160單克隆抗體的研制能夠為進一步開展對CD160在機體免疫應答中的生物學效應的研究以及與其他共刺激信號之間的復雜網絡關系提供工具，進而

2、深入探討和分析臨床相關疾病診斷，以及有效治療提供了可靠手段。
　　第一部分人CD160基因克隆及其基因轉染細胞株的建立
　　【目的】構建穩(wěn)定表達人CD160基因轉染細胞株。
　　【方法】通過RT-PCR獲得人CD160全長cDNA，然后以cDNA進行目的基因的大量擴增，并將插入逆轉錄病毒表達載體pEGZ-Term。經測序正確后，通過脂質體法將重組逆轉錄病毒載體pEGZ-Term/CD160和輔助病毒載體共轉染包裝細胞2

3、93T，收集含有完整重組逆轉錄病毒顆粒的293T細胞培養(yǎng)上清，用以感染L929細胞；采用Zeocin篩選，并通過流式細胞術與RT-PCR的方法反復鑒定，成功獲得具有Zeocin抗性且細胞膜表面能穩(wěn)定表達CD160分子的基因轉染細胞CD160/L929。
　　【結果】成功克隆人CD160全長cDNA，并成功構建穩(wěn)定表達人CD160的基因轉染細胞株L929/CD160。
　　【結論】本研究成功構建了穩(wěn)定表達人CD160的基因轉染

4、細胞株，為研制鼠抗人CD160單克隆抗體和研究CD160生物學功能奠定了基礎。
　　第二部分鼠抗人CD160單克隆抗體的研制
　　【目的】研制鼠抗人CD160單克隆抗體。
　　【方法】以穩(wěn)定表達人CD160的基因轉染細胞株L929/CD160為免疫原，免疫6~8周齡的BALB/c小鼠；采用經典的B淋巴細胞雜交瘤技術，將免疫小鼠的脾臟細胞與骨髓瘤細胞SP2/0進行細胞融合，并于HAT選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)；以L929/CD1

5、60作為陽性篩選細胞株，并以轉染pEGZ-Term空載體的L929/mock細胞株作為陰性對照，采用流式細胞術對雜交瘤細胞進行篩選；對所得陽性雜交瘤細胞進行多次克隆化培養(yǎng)，直至獲得持續(xù)穩(wěn)定分泌特異性鼠抗人CD160單克隆抗體的雜交瘤細胞株；采用Westen blot和競爭結合抑制實驗，對獲得的雜交瘤細胞進行生物特性方面的鑒定；采用間接免疫熒光法和流式細胞術分析CD160在健康人PBMC中T細胞表面的表達。
　　【結果】獲得l株持續(xù)

6、穩(wěn)定分泌鼠抗人CD160單克隆抗體的雜交瘤細胞株，命名為5A7。經快速定性試紙分析鑒定，5A7的重鏈為IgG，輕鏈為κ鏈；采用本科室建立的腹水誘生方法制備單克隆抗體，腹水的收獲量平均為3ml/只，經protein G親和柱分離純化?？贵w的抗原表位競爭抑制試驗表明，單克隆抗體5A7與商品化抗體識別的抗原表位不同。間接免疫熒光分析結果顯示：單抗5A7能夠特異性識別人CD160分子，并且能夠識別健康人PBMC中T細胞表面的CD160分子。