潰結(jié)靈對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸粘膜TLRs-NF-κB通路的作用.pdf

1、本研究擬從細胞因子、粘附分子表達的源頭 TLRs/NF-κB 通路入手，觀察KD對此通路的一些關(guān)鍵環(huán)節(jié) TLR2、TLR4、NF-κB 及其中間環(huán)節(jié)IκB-α、IKK-α和下游細胞因子TNF-α、IL-1β、粘附分子ICAM-1 的作用，探討KD治療UC的深層次作用機理。這一研究將使中醫(yī)藥治療UC的機理研究深入到基因調(diào)控水平，并為開發(fā)高質(zhì)量的抗UC 中藥新藥打下堅實的基礎(chǔ)，有重要的理論意義和廣闊的應(yīng)用前景。 1 KD對UC 大鼠

2、結(jié)腸粘膜中 IL-1β、TNF-α的作用細胞因子尤其是促炎因子在UC 的發(fā)病及進展中起到了重要的作用，其中IL-1β和TNF-α最具代表性。本研究觀察KD 對 UC 大鼠結(jié)腸粘膜中 IL-1β、TNF-α的作用，對其作用機制進行初步探討。KD采用中、高劑量對TNBS法UC大鼠模型進行治療，治療結(jié)束采集結(jié)腸粘膜標本，采用雙抗體夾心 ABC-ELISA 法檢測結(jié)腸粘膜中 IL-1β、TNF-α的含量，并進行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果表明模型組結(jié)腸粘膜

3、中 TNF-α和IL-1β的含量分別為 99.35±36.67 pg/mL和160.90±51.78 pg/mL，明顯高于正常組(分別為33.06±10.97 pg/mL和35.64±11.17 pg/mL，P<0.01)。KD高劑量組結(jié)腸粘膜樣本中TNF-α的含量為40.66±6.58pg/mL，明顯低于模型組(P<0.01)；KD高、中劑量組結(jié)腸粘膜樣本中IL-1 β的含量分別為67.30±32.57pg/mL 和69.32±31.

4、24pg/mL，明顯低于模型組(P<0.01)。提示KD能夠降低UC大鼠結(jié)腸粘膜中促炎因子IL-1β、TNF-α的含量，這可能是其治療UC作用的機理之一。 2 KD對UC大鼠結(jié)腸粘膜ICAM-1基因表達的作用近年來，粘附分子與UC的關(guān)系越來越受到人們的重視，其中尤以細胞間粘附分子(ICAM-1)與UC的活動和轉(zhuǎn)歸關(guān)系密切。本研究觀察KD對TNBS法UC大鼠模型結(jié)腸粘膜 ICAM-1 基因表達的作用，探討其作用機制。大鼠隨機分為以

5、下六組：正常組、模型對照組、KD低、中、高三個劑量組和陽性藥SASP組。治療十天后處死大鼠并采集結(jié)腸粘膜標本。用Trizol 提取總 RNA，采用 RT-PCR 法檢測 ICAM-1 的基因表達，以β-actin 作為內(nèi)參，產(chǎn)物進行凝膠電泳分離，用凝膠成像儀自帶分析軟件進行灰度分析，以ICAM-1 與β-actin 的灰度值比值作為ICAM-1 基因的相對表達量，進行組間比較分析。結(jié)果表明模型組ICAM-1基因相對表達量是1.044±0

6、.180，明顯高于正常組(0.359±0.119，P<0.01)：KD中劑量組TCAM-1相對表達量為0,797±0,210，明顯低于模型組(P<0.05)，KD高劑量組和陽性藥SASP組ICAM-1相對表達量分別是0.555±0.184和0.635±0.242，明顯低于模型組(P<0.01)。提示KD對TNBS法UC大鼠結(jié)腸粘膜ICAM-1基因表達有抑制作用，這可能是其抗UC作用的機理之一。 3 KD對UC大鼠結(jié)腸粘膜NF-κ

7、B p65的DNA 結(jié)合活性的作用TNF-α、IL-1 β及ICAM-1的表達與NF-κB的活化密切相關(guān)。本研究在前面研究的基礎(chǔ)上，對結(jié)腸粘膜NF-κB P65DNA結(jié)合活性進行檢測。分組和治療同前述，治療結(jié)束后處死大鼠并取新鮮結(jié)腸粘膜標本提取核蛋白，利用以ELISA為基礎(chǔ)的Trans AM TMNF-κBp65試劑盒檢測NF-κBp65的DNA結(jié)合活性，并進行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果表明模型組結(jié)腸粘膜NF-κ B相對活性為0.440±0.11

8、9，明顯高于正常對照組(0.261±0.042，P<0.01)；KD高劑量組和陽性藥SASP組結(jié)腸粘膜NF-κ B相對活性分別為0.26l±0.056、0.269±0.106，均明顯低于模型組(P<0.01)。提示KD對TNBS法UC大鼠模型結(jié)腸粘膜NF-κ B活性明顯降低，這可能也是其治療UC作用的機理之一。 4 KD對UC大鼠結(jié)腸粘膜 TLR2、TLR4 蛋白水平的作用TLRs是NF-κB激活的 TLRs/NF-κB通路的重

9、要環(huán)節(jié)，TLRs 對腸腔內(nèi)病原模式識別分子(PAMPs)進行模式識別，經(jīng)一系列信號傳導(dǎo)分子最終促發(fā)NF-κB核因子的激活。本研究觀察了KD對TNBS法UC大鼠模型結(jié)腸粘膜TLR2、TLR4蛋白水平的作用，對其作用機制進行探討。分組和治療同前述，治療結(jié)束后采集結(jié)腸粘膜標本并提取全細胞蛋白，運用蛋白免疫印跡(Western blot)方法對TLR2和TLR4的蛋白表達水平進行檢測，以β-actin 作為內(nèi)參，以目的蛋白與β-actin的密度

10、比值作為目的蛋白的相對含量，進行組間比較分析。結(jié)果模型組TLR2、TLR4蛋白相對表達量分別是0.663±0.137和0.843±0.201，均明顯高于正常組(分別為0.254±0.052、0.472±0.072)(P<0.01)；KD中、高劑量組TLR2相對表達量分別為0.472±0.160和0.376±0.104，明顯低于模型組(P<0.05和P<0.01)；KD高劑量組TLR4相對表達量為0.620±0.178，明顯低于模型組(P

11、<0.05)。提示KD對TNBS法UC大鼠模型結(jié)腸粘膜TLR2、TLR4 蛋白表達有抑制作用，這可能是其抗UC作用的機理之一。 5 KD對UC大鼠結(jié)腸組織I κB-Q、IKK-α蛋白表達的作用I κ B-α、IKK-α是 TLRs/NF-κB通路的中間環(huán)節(jié)，I κ B的磷酸化是激活NF-κ B系統(tǒng)的關(guān)鍵步驟，IKK的活化是 NF-κB激活途徑中的限速步驟。TNBS所致大鼠UC的發(fā)生與NF-κB的活化及TLR2、TLR4 蛋白的高

12、表達密切相關(guān)，KD對UC大鼠模型過度激活的NF-κB 和過度表達的TLR2、TLR4 蛋白水平有下調(diào)作用，在此基礎(chǔ)上本研究對UC大鼠結(jié)腸組織I κ B-α、IKK-α蛋白表達進行檢測，以期對KD治療UC的較深層次的作用機理進行探討。分組和治療同前述，治療結(jié)束后取結(jié)腸組織固定，切片進行免疫組化染色，光鏡下分別計數(shù)I κ B-α和IKK-α陽性細胞表達率，并進行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果模型組結(jié)腸組織I κ B-α、：IKK-α蛋白陽性細胞表達率為3

13、6.3±11.9％和35.3±12.0％，明顯高于正常對照組 (分別為 14.8±5.1％和11.0±4.4％，P<0.01)；KD 高劑量組結(jié)腸組織I κ B-α蛋白陽性細胞表達率為26.2±8.6％，明顯低于模型組(P<0.05)，KD 中劑量組結(jié)腸組織 IKK-α蛋白陽性細胞表達率為25.3±7.0％，明顯低于模型組(P<0.05)，KD高劑量組和陽性藥SASP組結(jié)腸組織 IKK-α蛋白陽性細胞表達率分別為20.2±6.0％和22

14、.3±6.2％，明顯低于模型組(P<0.01)。提示KD對TNBS法UC大鼠模型結(jié)腸組織Iκ B-α、IKK-α蛋白陽性細胞率明顯降低，這可能是其治療UC作用的機理之一。 總之，TLRs/NF-κB 通路在UC的發(fā)生發(fā)展中占舉足輕重的地位，NF-κB對UC發(fā)病的關(guān)鍵性細胞因子如 TNF-α、IL-1β等和 ICAM-1 有調(diào)控作用，從而參與了UC腸道的炎癥和免疫反應(yīng)。當上游刺激因子如 TNF-α、IL-1β等與TLRs 結(jié)合，T

15、LRs 向細胞內(nèi)傳遞活化信號，激活NF-κB，進而調(diào)節(jié)炎癥遞質(zhì)的產(chǎn)量，導(dǎo)致UC 炎癥粘膜的損傷。NF-κB活化后會產(chǎn)生持續(xù)擴大的炎癥反應(yīng)，使病情不斷進展。對 TLRs/NF-κB通路中的關(guān)鍵環(huán)節(jié) NF-κ B、TLRs 及其中間環(huán)節(jié) Iκ B-α、IKK-α和上 (下)游分子TNF-α、IL-1β、ICAM-1 進行干預(yù)，可以有效地阻止UC 的進程，達到治療目的。本研究選用清熱健脾活血中藥復(fù)方KD治療大鼠實驗性UC，取得較好的治療效果，