高糖刺激下Tribble3在人臍靜脈內皮細胞中的表達及其與凋亡的關系.pdf

1、血管內皮細胞是血管病變的關鍵部位，自Ross提出“炎癥反應”學說后，內皮凋亡逐漸被認為動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）病變的始動環(huán)節(jié)。在AS發(fā)生早期，AS易發(fā)區(qū)的血管內皮細胞具有凋亡現(xiàn)象，內皮細胞凋亡可加速AS的進程釋放各種促AS因子，而后者又可進一步加重AS進展，形成惡性循環(huán)。越來越多的體內和體外實驗證實，高糖能夠介導內皮細胞的功能紊亂和凋亡。其中，高血糖誘導的血管內皮細胞凋亡，不僅造成血管壁通透性增加，也使血管內

2、皮喪失正常的調節(jié)舒縮、抗粘附等功能，被認為是糖尿病加速動脈粥樣硬化引起大血管并發(fā)癥的重要機制。然而，高糖促進內皮細胞凋亡的機制尚未完全闡明。 晚近有研究發(fā)現(xiàn)，Tribble3通過對Akt活性的抑制，不僅促進細胞凋亡，而且引起空腹血糖明顯增高，提示TRIB3可能是糖尿病和AS之間聯(lián)系的靶點之一。TRIB基因最早是在果蠅體內發(fā)現(xiàn)的，也被稱為神經(jīng)細胞死亡誘導蛋白激酶，在果蠅發(fā)育早期抑制有絲分裂。人類TRIB家族包括TRIB1、TRIB

3、2、TRIB3，可以在多種細胞如血管平滑肌細胞、巨噬細胞、Hela細胞中表達，且其表達調節(jié)具有細胞特異性。果蠅TRIB3是哺乳動物的同系物，因此，有關TRIB基因的研究主要集中在TRIB3。TRIB3可能具有廣泛的生物活性，在空腹狀態(tài)下，db—/db—小鼠（一種基因缺陷糖尿病小鼠）肝臟TRIB3的mRNA及蛋白合成顯著增高，繼而導致空腹狀態(tài)下肝糖輸出增多，血糖水平升高。TFRIB3可能不僅是糖尿病糖耐量異常的原因，而且可能是高血糖的結果

4、。但迄今為止，血管內皮細胞上是否存在TRIBs的表達，高糖是否可促進其表達，以及TRIB3在高糖誘導的血管內皮細胞凋亡中的作用未見報道。鑒于以上問題，構成本研究的設計思路和研究目的。 研究目的: 1.采用高糖刺激人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）的模型，用甲基噻唑基四唑（Methylthiazolyl tetrazolium，MTT）法檢測細胞的存活率； 2.采用實時定量逆轉錄聚合酶鏈反應（real time RT

5、—PCR）法探討TRIBs mRNA表達量與高糖濃度和刺激時間的關系； 3.采用免疫熒光法與蛋白免疫印跡（Western—Blot）法檢測TRIB3，觀察其蛋白表達量與高糖刺激時間的關系； 4.采用siRNA轉染抑制TRIB3表達，Annexin V—FITC/PI雙染流式細胞儀檢測細胞的凋亡率，探討TRIB3在高糖誘導的血管內皮細胞凋亡中的作用。 研究對象與方法: 本研究以第3～5代HUVECs為研究對

6、象。采用MTT法、細胞免疫組織化學、RT—PCR、Western blotting、Annexin V—FITC/PI雙染法等實驗方法，分別觀察： 1.加入不同濃度葡萄糖（5.5、10、20、30、40mmol/L）分別培養(yǎng)24h、48h、72h，采用MTT法檢測HUVECs細胞存活率： 2.在體外模擬糖尿病狀態(tài)，30mmol/L高糖刺激內皮細胞4h、8h、12h、24h、48h、72h，采用SYRB GreenⅠ染料法

7、熒光實時定量PCR檢測TRIBs mRNA表達；不同濃度高糖（10、20、30、40mmol/L）及正常條件下刺激內皮細胞24小時后，檢測TRIBs mRNA表達；30mmol/L高糖、25mmol/L甘露醇、正常條件下刺激內皮細胞4h、8h、12h、24h、48h、72h，檢測TRIB3 mRNA表達； 3.給予30mmol/L高糖分別刺激HUVECs24h、48h，同時設有對照組，免疫熒光法觀察高糖刺激后TRIB3蛋白的表達

8、變化； 4.Western—Blot法檢測30mmol/L高糖刺激內皮細胞0h、24h、48h、72h后，TRIB3蛋白的表達； 5.化學合成TRIB3 siRNA，采用脂質體轉染HUVECs以抑制TRIB3表達后，Annexin V—FITC/PI雙染流式法檢測高糖刺激48h后HUVECs的凋亡變化。 結果: 1.MTT檢測不同濃度葡萄糖對HUVECs存活率的影響：與對照組相比，不同濃度葡萄糖刺激24小

9、時后，HUVECs的存活率差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；與對照組相比，20、30、40 mmol/L葡萄糖處理48h、72h后，HUVECs的存活率顯著降低（P<0.05），并有濃度依賴性，隨著高糖濃度的增加，細胞存活率逐漸降低。與24h相比，20、30、40 mmol/L葡萄糖處理48h、72h后，細胞存活率降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），提示細胞存活率具有時間依賴性，隨著高糖刺激時間的增加，細胞存活率逐漸降低。

10、 2.30mmol/L高糖刺激HUVECs4h、8h、12h、24h、48h、72h，結果顯示，TRIB1、TRIB2、TRIB3均能在HUVECs中表達，高糖可引起TRIB3 mRNA表達呈時間依賴性增加。與對照組相比，高糖刺激12h后，TRIB3 mRNA表達量增多（P<0.05），24h表達量最高（P<0.01），48h表達量其次（P<0.01）。TRIB1、TRIB2mRNA表達略有增加，與高糖刺激時間之間無明顯規(guī)律。

11、3.不同濃度葡萄糖處理HUVECs24小時，結果顯示，與對照組相比較，不同濃度（20、30、40mmol/L）的高糖處理內皮細胞24h后，TRIB3 mRNA表達量明顯增加（P<0.05），TRIB1、TRIB2 mRNA表達增加但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。且高糖刺激HUVECs TRIB3 mRNA表達增加呈劑量依賴性，30mmol/L高糖刺激作用最強。與對照組相比，30mmol/L高糖刺激HUVECs24小時后，TRIB3

12、mRNA增加7.2倍（P<0.01）。 4.不同作用時間下，以正常濃度、30mmol/L高糖、高滲處理HUVECs，結果顯示，與對照組相比，30mmol/L葡萄糖組TRIB3 mRNA12h開始升高，24h達到峰值，其后逐漸降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。與對照組相比，高滲組TRIB3mRNA僅輕度增多，差異無統(tǒng)計學意義。提示高糖促進TRIB3 mRNA的合成與時間有關，且這一作用與高糖引起的高滲環(huán)境無關。 5

13、.以TRIB3 IgG為一抗，免疫熒光染色可見，對照組、24h高糖組、48h高糖組的細胞核熒光染色，而細胞漿未見明顯染色，表明TRIB3在HUVECs的細胞核內表達，胞漿內不表達或表達量很少；24h高糖組的細胞核免疫熒光最強，其次為48h高糖組，對照組的免疫熒光最弱，表明高糖刺激24小時時TRIB3表達量最高。 6.30mmol/L高糖刺激24h、48h、72h后，Western Blot結果顯示，與對照組相比較，72小時TRI

14、B3蛋白表達量差異無統(tǒng)計學意義，24小時及48小時TRIB3蛋白表達量顯著增加（P<0.05），24小時蛋白表達量最高，為正常的5.44倍（P<0.01）。 7.篩選最佳抑制效果TRIB3 siRNA的濃度抑制TRIB3表達后，30mmol/L高糖刺激HUVECs細胞48h，Annexin V—FITC/PI雙染流式法結果顯示，與高糖組相比較，干擾組細胞凋亡量明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。 結論: