松花粉多糖硫酸酯化前后對(duì)肝癌細(xì)胞增殖與細(xì)胞周期的影響.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)室研究曾表明，馬尾松花粉多糖(PPM60)及其硫酸酯化衍生物(SPPM60)均能通過增強(qiáng)免疫抑制小鼠體內(nèi)S180肉瘤，且SPPM60作用更強(qiáng)。PPM60對(duì)體外培養(yǎng)的人白血病K562細(xì)胞有較強(qiáng)的抑制作用，而硫酸酯化多糖SPPM60卻降低了其抑制作用；PPM60抑制K562細(xì)胞的機(jī)制可能是升高細(xì)胞內(nèi)鈣離子和活性氧濃度，阻滯細(xì)胞于G0/G1期，并誘導(dǎo)K562細(xì)胞產(chǎn)生凋亡。本實(shí)驗(yàn)擬以人肝癌細(xì)胞株HepG2為研究對(duì)象，考察多糖硫酸酯化前后對(duì)

2、人肝癌細(xì)胞增殖與細(xì)胞周期的影響，并對(duì)其體外抗腫瘤的作用機(jī)制進(jìn)行初步探討，以期為馬尾松花粉多糖及其酯化物應(yīng)用于腫瘤的輔助治療提供理論依據(jù)。實(shí)驗(yàn)主要分為以下幾個(gè)部分。
　　一、馬尾松花粉多糖的提取、分離純化、酯化及鑒定:采用水煮醇沉法對(duì)1000g馬尾松花粉提取多糖，得到60％乙醇分級(jí)沉淀多糖(PPM60)為5.461g。采用Sephacryl S-400HR層析對(duì)PPM60分離純化，得到三種不同分子量的多糖組分，分別命名為PPM60-

3、A、PPM60-B、PPM60-C。采用氯磺酸-吡啶法對(duì)PPM60及各純化組分進(jìn)行硫酸酯化改性，改性后分別命名為SPPM60、SPPM60-A SPPM60-B、SPPM60-C，用氯化鋇-明膠比濁法鑒定其硫酸根含量并計(jì)算取代度(DS)分別為1.611、1.4、1.45、0.968。紅外光譜顯示已具有硫酸酯鍵(C-O-S和S=O)的特征吸收峰，表明多糖已被硫酸酯化。
　　二、多糖酯化前后對(duì)HepG2細(xì)胞生長能力的影響:MTT法檢測(cè)

4、不同濃度SPPM60或 PPM60作用不同時(shí)間對(duì)人肝癌細(xì)胞株 HepG2增殖活力的影響。SPPM60對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖有抑制作用，一定程度上具有劑量和時(shí)間依賴性。在200?g/mL和400?g/mL濃度下作用72h，SPPM60對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制率分別為38。21％和39.16％。而PPM60對(duì)HepG2細(xì)胞沒有抑制作用，甚至在某些條件下有輕微的促增殖作用。比較了兩種不同取代度的SPPM60(SPPM60-1、SPPM60-2，

5、DS為1.226和1.611):在200?g/mL濃度下作用72h，對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制率分別為40.25％和53.34％，高DS的抑制率與低DS相比，具有顯著性差異。
　　三、多糖酯化前后對(duì)HepG2細(xì)胞周期的影響:流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)SPPM60-2或PPM60處理前后HepG2細(xì)胞周期分布的變化。SPPM60-2組較對(duì)照組G2/M期細(xì)胞比例顯著性增加，S期比例均顯著性減少，G0/G1期比例沒有明顯變化，細(xì)胞被阻滯在G2/M期。

6、PPM60組細(xì)胞周期變化很小。Real-time PCR結(jié)果顯示，SPPM60-2可以下調(diào)CDK1、CyclinB的mRNA表達(dá)水平和上調(diào)p53和p21的mRNA表達(dá)，與對(duì)照組相比具有顯著性差異，而PPM60處理組各基因的mRNA表達(dá)水平，與對(duì)照組相比差異不顯著。
　　四、多糖酯化前后對(duì)HepG2細(xì)胞分泌VEGF的影響:SPPM60-2與SPPM60B均能使HepG2細(xì)胞培養(yǎng)上清中VEGF的表達(dá)有不同程度的下調(diào)，分別與對(duì)照組和PP

7、M60組相比較，均具有極顯著性差異。
　　以上結(jié)果表明:(1)PPM60對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖幾乎沒有什么影響，硫酸酯化以后產(chǎn)生了不同程度的抑制作用，且高取代度的硫酸酯化多糖對(duì)HepG2細(xì)胞有較高的抑制率。(2)SPPM60-2抑制HepG2細(xì)胞增殖的機(jī)制是在轉(zhuǎn)錄水平上下調(diào)CDK1和CyclinB的mRNA表達(dá)和上調(diào)p53和p21的mRNA表達(dá)，使細(xì)胞周期阻滯于G2/M期，抑制細(xì)胞的分裂。(3)在HepG2細(xì)胞中，SPPM60-2