Tiam1基因在肝癌中的表達及其與預后的相關性研究.pdf

1、目的： 本研究擬應用自行設計的包括部分常見惡性腫瘤組織和正常組織的組織芯片，采用免疫組化方法檢測和觀察人體正常組織和常見惡性腫瘤組織，152例肝癌組織和8種人肝癌細胞株及1種人正常肝細胞株Tiaml蛋白的表達情況；分析Tiaml蛋白在肝癌中的表達及其與各臨床病理參數(shù)之間的關系，同時結合臨床隨訪資料回顧性分析Tiaml蛋白表達與肝癌患者生存期的關系，尋找提高肝癌預后評價敏感性和特異性的方法；利用基因沉默技術初步研究Tiaml基因在

2、肝癌增殖、侵襲中的作用，探討Tiaml作為肝癌分子靶點的可行性；為肝癌患者的診斷、預后評價、綜合治療方案設計提供有力的理論依據(jù)。 方法： 1、Tiaml蛋白在人體正常組織和常見惡性腫瘤組織的分布和表達研究 自行設計并制作了包括鼻咽癌、肺鱗癌、肺腺癌、食道鱗癌、食道腺癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、肝癌、胰腺癌、乳腺癌、腎透明細胞癌、宮頸癌、卵巢癌、前列腺癌、膀胱移行上皮癌、腦膠質瘤、皮膚鱗狀細胞癌、彌漫性大B細胞淋巴瘤

3、等19種惡性腫瘤及鼻咽、肺、食道、胃、結腸、直腸、纖維平滑肌、肝、胰腺、乳腺、膀胱、子宮頸、卵巢、腎、前列腺、淋巴結、皮膚、腦等18種正常組織的組織芯片，結合免疫組化方法檢測Tiaml蛋白在人體正常組織和常見惡性腫瘤組織的分布和表達。 2、Tiaml基因/蛋白在人正常肝細胞和肝癌細胞中的表達研究 應用熒光定量PCR、免疫細胞化學、Westernblot、細胞免疫熒光等方法檢測HepG2、Hep3B、SMMC-7721、Q

4、Gy-7701、QGy-7703、BEL-7402、BEL-7404、BEL-7405等8種肝癌細胞株和人正常肝細胞株HL-7702中的Tiaml基因/蛋白的表達情況。 3、Tiaml蛋白在肝癌組織中的表達及臨床意義 應用免疫組化EnVisionTM二步法檢測Tiaml蛋白在152例肝癌組織中的表達情況；應用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學處理，采用x2檢驗分析Tiaml蛋白表達水平與各臨床病理參數(shù)之間的關系；采用Kapl

5、an-Meier法回顧性分析Tiaml蛋白表達與肝癌患者生存期的關系；以COX回歸對各項指標單因素或多變量聯(lián)合與生存期的關系進行統(tǒng)計學分析。 4、Tiaml基因表達沉默對肝癌細胞生物學特性的影響 利用在線數(shù)據(jù)庫和軟件設計Tiaml基因干擾片段，用含Tiaml基因的干擾片段瞬時轉染肝癌細胞株QGy-7701細胞，熒光定量PCR和Westernblot檢測Tiaml基因干擾效率。利用MTT法及流式細胞術檢測Tiaml基因沉默

6、后對細胞體外增殖的影響；利用體外侵襲小室進行體外侵襲實驗，檢測Tiaml基因沉默后對肝癌侵襲能力的影響。 結果： 1、Tiaml蛋白在人體正常組織和常見惡性腫瘤組織中的分布和表達情況 Tiaml蛋白在正常組織中的乳腺纖維組織、胰腺、肝組織未見陽性表達，而在鼻咽、肺、食道、胃、結腸、直腸、纖維平滑肌、膀胱、子宮頸、卵巢、腎、前列腺、淋巴結、皮膚、腦等15種正常組織中可見不同程度的Tiaml蛋白陽性表達。其中在前列腺

7、增生組織腺上皮、增生平滑肌組織、腎臟遠曲小管上皮細胞、血管壁平滑肌等組織中可見Tiaml蛋白中到高表達。Tiaml蛋白在鼻咽癌、乳腺癌、肺鱗癌、肺腺癌、結腸癌、直腸癌、肝癌、前列腺癌、卵巢癌、彌漫性大B細胞淋巴瘤等10種腫瘤組織中高表達；在食道鱗癌、食道腺癌、胃癌、胰腺癌、腎透明細胞癌、宮頸癌、膀胱移行上皮癌、腦膠質瘤、皮膚鱗狀細胞癌等9種腫瘤組織中可見Tiaml蛋白低表達。此外，我們還發(fā)現(xiàn)肝癌癌旁肝硬化組織和伴有纖維組織明顯增生的肝組

8、織中也可見Tiaml蛋白低到中度表達，但表達強度明顯弱于肝癌組織，且范圍小于肝癌組織。 2、Tiaml基因在肝癌細胞株和正常肝細胞株中的表達情況 采用熒光定量PCR法檢測8種人肝癌細胞株和1種人正常肝細胞株中Tiaml基因的表達情況。單因素方差分析的結果表明：9種細胞株中Tiaml基因的表達差異具有顯著性(F=80.514，P<0.001)，Tiaml基因在8種肝癌細胞中的表達水平均明顯高于正常肝細胞中的表達水平，差異具

9、有統(tǒng)計學意義。 3、Tiaml蛋白在肝癌細胞株和正常肝細胞株中的表達情況 免疫細胞化學檢測結果顯示，Tiaml蛋白在正常肝細胞株中不表達，在肝癌細胞株中陽性表達。Westernblot及細胞免疫熒光檢測結果與免疫細胞化學結果一致。 4、Tiaml蛋白在肝癌組織中的表達及臨床意義 免疫組化檢測結果顯示Tiaml蛋白在152例肝癌組織中的總陽性表達率為88.1％，而在正常組織中呈陰性表達。肝癌組織中各級表達所

10、占比例分別為：“一”占11.9％(18/152)，“+”占24.3％(37/152)，“++”占39.5％(60/152)，“+++”占24.3％(37/152)。Tiaml蛋白表達與肝癌患者的性別、年齡、腫瘤大小、分化程度、肝硬化、轉移、復發(fā)、血清HBsAg、血清AFP均無相關性(P>0.05)。隨訪發(fā)現(xiàn)，Tiaml蛋白高表達肝癌患者中位生存時間為27.0個月，低于Tiaml蛋白低表達患者中位生存時間60.0個月，Tiaml高表達患者

11、與低表達患者生存時間有顯著性差異(P=0.008<0.05)。將Tiaml蛋白表達和臨床病理參數(shù)綜合與肝癌患者的生存時間進行單因素分析，結果顯示Tiaml蛋白高表達、腫瘤大小、轉移、復發(fā)和血清AFP值是影響肝癌患者生存時間的重要因素(P值分別為：0.009、0.002、0.030、0.035、0.002)。多因素分析，發(fā)現(xiàn)Tiaml蛋白高表達、腫瘤大小和血清AFP值分別是影響肝癌生存預后的獨立因素(P值分別為：0.042、0.008、0

12、.001)。 5、Tiaml基因表達沉默對肝癌細胞生物學特性的影響 利用軟件設計合成Tiaml基因的特異性干擾片段，瞬時轉染QGy-7701細胞后，熒光顯微鏡測定轉染效率為60％～70％。熒光定量PCR和Westernblot結果顯示Tiaml基因干擾效率達72％(命名為QGy-7701/Tiaml-細胞)。 MTT法觀察Tiaml基因表達沉默后體外細胞的增殖情況，與QGy-7701細胞相比，QGy-7701/T

13、iaml-細胞的增殖速度明顯減慢，并且呈時間依賴關系(F=237.790，P<0.001)。利用流式細胞術檢測兩組細胞的細胞周期結果顯示QGy-7701/Tiaml-細胞周期中S期的比例明顯減少(t=14.177，P<0.001)，表明Tiaml基因表達沉默后細胞增殖緩慢。結果提示Tiaml基因表達水平減低后，腫瘤細胞體外生長被顯著抑制。 體外侵襲小室實驗檢測Tiaml基因表達沉默后細胞侵襲能力的改變，結果顯示，與QGy-770

14、1細胞相比，QGy-7701/Tiaml-細胞的侵襲能力明顯降低(t=18.054，P<0.001)，說明Tiaml基因的沉默抑制了肝癌細胞的侵襲能力。 結論： 1.Tiaml蛋白在多種腫瘤組織中高表達，表明Tiaml可能是導致腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要分子； 2.Tiaml蛋白在肝癌組織中高表達，在肝硬化組織中弱表達，而在正常肝組織中不表達，提示Tiaml可作為臨床肝癌檢測的有重要參考價值的標志物； 3.Tia

15、ml蛋白高表達結合臨床隨訪資料分析，表明Tiaml與患者預后密切相關，提示Tiaml可作為肝癌預后判斷的重要指標，對判斷肝癌預后有重要意義； 4.Tiaml基因沉默后可抑制肝癌細胞的增殖和侵襲，表明Tiaml基因可促進肝癌細胞的增殖和侵襲，提示Tiaml基因在肝癌細胞的增殖和侵襲中起重要作用。 本研究的創(chuàng)新之處： 1.發(fā)現(xiàn)Tiaml與肝癌的增殖、侵襲及預后相關，為開展肝癌基因靶向治療奠定了理論基礎； 2.