棉花細胞質(zhì)雄性不育系線粒體基因組細菌人工染色體文庫的構建及其鑒定.pdf

1、棉花是我國主要的經(jīng)濟作物之一，隨著我國紡織工業(yè)和人民生活水平的提高，中國已經(jīng)成為世界上最大的棉花生產(chǎn)國和消費國，對棉花的需求量在不斷增加，為了滿足人們的需求，培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的棉花新品種是解決問題的必然途徑。利用棉花細胞質(zhì)雄性不育(Cytoplasmic male sterility，CMS)系培育棉花雜交品種成為當今世界棉花育種的主要研究方向。大量的研究表明，細胞質(zhì)雄性不育與線粒體DNA的變異有密切的聯(lián)系。因此，為了更好的研究細胞質(zhì)雄性

2、不育與線粒體DNA之間的關系，本研究將構建棉花的線粒體基因組細菌人工染色體文庫，并對文庫進行了初步的評價，為更深入的了解和解釋細胞質(zhì)雄性不育與線粒體之間的關系打下扎實的基礎。 本研究以陸地棉細胞質(zhì)雄性不育系P30A的黃化苗為材料，參考水稻、玉米等主要農(nóng)作物線粒體基因組細菌人工染色體文庫的構建方法，并結合棉花本身含有棉酚、單寧等易氧化物質(zhì)的特殊性，建立了一套構建高質(zhì)量線粒體基因組BAC文庫的體系。該體系包含三個至關重要的條件：高分

3、子質(zhì)量的mtDNA的提取、脫磷效果較好的載體的制備、轉(zhuǎn)化效率較高的感受態(tài)細胞的制備。 在分離制備線粒體及其DNA的過程中，利用蔗糖不連續(xù)密度梯度超速離心獲得的線粒體經(jīng)熒光鏡檢測表明其完整性好、無葉綠體和細胞核等污染，利用包埋裂解獲得的線粒體DNA經(jīng)過溶膠酶切、PCR擴增等檢測反應表明所提取的線粒體DNA的純度較高、質(zhì)量較好；對制備的載體經(jīng)過自連反應檢測，脫磷效果較好，自連效率低；對制備的感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化效率進行檢測，表明其已達到1

4、.22×10<'10>cfu/μ g，即大于10<'10>cfu/μg。進一步表明，上述的三個條件完全符合構建棉花線粒體基因組細菌人工染色體文庫的要求。 本研究利用所建立的BAC文庫構建技術體系，成功的構建了陸地棉細胞質(zhì)雄性不育系P30A線粒體基因組細菌人工染色體文庫。該文庫以單克隆形式保存，包含約3840個克隆子，平均插入片段約15.5kb，重組率大于93﹪，空載率小于6.23﹪，克隆子的穩(wěn)定性好，覆蓋率超過80倍。此外，利用