紫草素對人氣道平滑肌細胞增殖的影響及其作用機制的探討.pdf

1、一、研究背景
　　 支氣管哮喘是氣道的慢性炎癥性疾病,其反復發(fā)作可引起氣道重構,導致不可逆性氣流阻塞及持續(xù)性非特異性氣道高反應性。其中氣道平滑肌細胞(airwaysmoothmusclecells,ASMCsl的增殖是氣道重構的重要因為之一。
　　 紫草素(shikonin)是從中國傳統(tǒng)中藥材一紫草的根中提取的一種萘醌類化合物,國內(nèi)外眾多研究表明紫草素及其衍生物具有明確的抗炎、抗氧化,抗細菌、真菌,抑制腫瘤細胞及血管平滑

2、肌細胞增殖、促進凋亡,抗血管新生,抗HIV等多種生物學效應。其是否對人氣道平滑肌細胞(humanairwaysmoothmusclecells,HASMCs)有抑制增殖的作用,國內(nèi)外尚未見相關研究。
　　 二、研究目的
　　 本實驗以體外培養(yǎng)的HASMCs為研究對象,觀察紫草素對HASMCs增殖的影響,并對其作用機制作初步的探討,為其治療支氣管哮喘氣道重構提供實驗依據(jù)。
　　 三、材料和方法1、經(jīng)患者同意,取南方

3、醫(yī)院胸外科同期做肺葉切除術患者的正常肺葉、段支氣管標本。
　　 2、組織塊貼壁法培養(yǎng)人支氣管平滑肌細胞,倒置顯微鏡觀察和抗平滑肌口肌動蛋白單克隆抗體(a-actin)免疫細胞化學法進行HASMCs鑒定。
　　 3、經(jīng)Oμmol/L,(對照組)及0.5、1、2、5、10、20、40μmol/L濃度的紫草素分別作用12、24、48h后,應用MTS法測定紫草素對HASMCs的細胞增殖的影響。
　　 4、經(jīng)Oμmol/L

4、(對照組)及5、10、20、40μmol/L濃度的的紫草素分別作用24h后,應用流式細胞術分析紫草素對細胞周期的影響。
　　 5、經(jīng)Oμmol/L(對照組)及20μmol/L濃度的紫草素分別作用24h后,應用SP免疫細胞化學法檢測紫草素對增殖細胞核抗原(proliferatingcellnuclearantigen,PCNA)及P21蛋白表達的影響。
　　 6、經(jīng)Oμmol/L(對照組)及20μmol/L濃度的紫草素分別

5、作用24h后,應用逆轉錄多聚酶鏈反應(Reversetranscriptionpolymerasechainreaction,RT-PCR)檢測紫草素對P21基因表達的影響。
　　 7、統(tǒng)計學處理所有數(shù)據(jù)均以χ±S表示,MTS結果采用重復測量數(shù)據(jù)的方差分析,兩樣本均數(shù)比較采用兩獨立樣本t檢驗,多組均數(shù)比較采用單向方差分析(One-WayANOVA),各組間比較采用LSD法。采用SPSS13.0軟件進行處理,以P<0.05表示差異

6、有統(tǒng)計學意義。
　　 四、結果
　　 1、HASMCs的形態(tài)及免疫細胞化學鑒定倒置顯微鏡下ASMCs呈長梭形,生長至融合后,細胞呈現(xiàn)出特征的“峰谷”狀。免疫細胞化學法對a-actin鑒定,光鏡下可見細胞漿中較多棕黃色顆粒。
　　 2、紫草素對HASMCs增值的影響在紫草素作用12h時,Oμmol/L(對照組)及0.5、1、2、5、10、20、40μmol/L濃度的紫草素組細胞吸光度(OD值)分別為:1.356±0

7、.203,1.370±0.314,1.439±0.942,1.304±0.120,1.235±0.256,1.347±0.285,0.978±0.097,0.707±0.066。
　　 在紫草素作用24h時,Oμmol/L(對照組)及0.5、1、2、5、10、20、40μmol/L濃度的紫草素組細胞OD值分別為:1.339±0.209,1.285±0.260,1.264±0.198,1.270±0.258,1.285±0.211

8、,1.291±0.181,0.918±0.212,0.718±0.214。
　　 在紫草素作用48h時,0μmol/L(對照組)及0.5、1、2、5、10、20、40μmol/L濃度的紫草素組細胞OD值分別為:1.084±0.166,1.081±0.246,1.062±0.268,1.061±0.283,1.197±0.189,1.227±0.163,0.833±0.368,0.749±0.424。
　　 統(tǒng)計學分析顯示

9、:0.5、1、2、5、10μmol/L紫草素組與對照組間OD值差異不顯著(F=932.578,P值分別為0.926、0.978、0.753、0.893、0.849)；20μmol/L和40μmol/L紫草素組與對照組OD值比較,差異有統(tǒng)計學意義(F=932.578,P值分別為0.033、0.003),但兩者之間差異不顯著(F=932.578,P=0.233)；不同濃度紫草素作用12h與24hOD值相比,無顯著性差異(F=6.491,P=

10、0.254)。但兩者與48hOD值相比,差異均有統(tǒng)計學意義(F=6.491,P值分別為0.018、0.007);時間與濃度無交互作用(P=0.905)。
　　 3、紫草素對HASMCs細胞周期的影響經(jīng)0μmol/L(對照組)及5、10、20、40μmol/L濃度的紫草素分別作用24h后,細胞G0/G1期比例分別為(75.0±9.0)％,(83.2±6.4)％,(85.O±6.5)％,(90.8±2.7)％,(91.7±2.4)％

11、。其中,5μmol/L和10μmol/L濃度的紫草素組與對照組間差異無統(tǒng)計學意義(F=3.884,P值分別為0.120、0.065)。20μmol/L和40μmol/L濃度的紫草素組與對照組間差異有統(tǒng)計學意義(F=3.884,P值分別為0.008、0.006),但兩者之間無顯著性差異(F=3.884,P=0.857)。
　　 細胞G2/M期比例分別為(8.8±5.9)％,(7.9±9.O)％,(7.5±6.9)％,(5.3±3.

12、4)％,(3.1±0.6)％,各組間無顯著性差異(F=0.459,P=0.765)。
　　 細胞S期比例分別為(13.2±7.6)％,(8.9±4.4)％,(7.5±4.5)％,(3.9±0.7)％,(4.8±1.0)％,各組間無顯著性差異(F=2.088,P=0.157)。
　　 4、紫草素對PCNA及P21蛋白表達的影響。
　　 經(jīng)0μmol/L(對照組)及20μmol/L濃度的紫草素分別作用24h后,細胞P

13、CNA陽性表達率分別為:(74.1±10.7)％,(41.8±3.1)％。二者差異有統(tǒng)計學意義(t=5.015,P=0.007)。
　　 經(jīng)0μmol/L(對照組)及20μmol/L濃度的紫草素分別作用24h后,細胞P21陽性表達率分別為:(9.3±2.5)％,(23.0±7.0)％。二者差異有統(tǒng)計學意義(t=3.182,P=0.033)。
　　 5、紫草素對P21基因表達的影響。
　　 經(jīng)0μmol/L(對照組

14、)及20μmol/L濃度的紫草素分別作用24h后,P21基因表達相對量分別為:0.311±0.007,0.571±0.149。二者差異有統(tǒng)計學意義(t=3.013,P=0.039)。
　　 五、結論
　　 1、20μmol/L和40μmol/L濃度的紫草素可抑制人氣道平滑肌細胞的增殖,其抑制作用以48h最強。
　　 2、20μmol/L和40μmol/L濃度的紫草素可提高人氣道平滑肌細胞G0/G1期細胞的比例,阻