香菇多糖對(duì)H2O2誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷的保護(hù)作用.pdf

1、阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一種以漸進(jìn)性記憶減退、認(rèn)知障礙及人格改變?yōu)橹饕R床特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性變性疾病，已成為繼心臟病、癌癥和中風(fēng)之后的第4號(hào)殺手，其主要病理特征為腦內(nèi)老年斑沉積、神經(jīng)元纖維纏結(jié)以及神經(jīng)元變性。AD具有復(fù)雜的病理生理過(guò)程，受多種因素影響，其中氧化應(yīng)激在A(yíng)D發(fā)病過(guò)程中起著重要作用。
　　 香菇多糖(lentinan, LNT)是從香菇的子體中提取、分離、純化的一組多糖成分，

2、具有提高機(jī)體免疫、抗腫瘤、抗病毒、保肝解毒、抗氧化、降血糖、降血脂、抗炎抗感染等作用。香菇多糖在臨床上已用于腫瘤、肝炎等的輔助治療，但其在A(yíng)D的作用還有待進(jìn)一步研究。
　　 本課題采用過(guò)氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)作為外源性自由基生成系統(tǒng)，以SH-SY5Y細(xì)胞代替神經(jīng)細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，模擬神經(jīng)細(xì)胞的氧化損傷，建立體外神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型，觀(guān)察香菇多糖對(duì)氧化損傷的SH-SY5Y細(xì)胞的保護(hù)作用及其可能的

3、機(jī)制，為其用于A(yíng)D的治療提供依據(jù)。
　　 1．香菇多糖對(duì)H2O2損傷SH-SY5Y細(xì)胞形態(tài)的影響
　　 細(xì)胞經(jīng)處理后于倒置顯微鏡下觀(guān)察并拍照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：正常組細(xì)胞胞體呈梭形、不規(guī)則的三角形或多邊形，有較短的軸突和樹(shù)突樣突起；H2O2模型組細(xì)胞數(shù)量減少，胞體皺縮，且有的細(xì)胞呈圓形；與模型組相比，香菇多糖各濃度保護(hù)組細(xì)胞數(shù)量增多，胞體皺縮現(xiàn)象明顯改善。
　　 2．香菇多糖對(duì)H2O2損傷SH-SY5Y細(xì)胞活力的影響

4、
　　 采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：SH-SY5Y細(xì)胞經(jīng)H2O2損傷后，細(xì)胞活力明顯降低(P＜0.01)；與模型組相比，0.1mg/L香菇多糖保護(hù)組細(xì)胞活力增強(qiáng)(P＜0.05)，1、10mg/L香菇多糖保護(hù)組則細(xì)胞活力明顯增強(qiáng)(P＜0.01)。
　　 3．香菇多糖對(duì)H2O2損傷SH-SY5Y細(xì)胞LDH漏出率的影響
　　 收集氧化損傷處理后的SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)上清液和細(xì)胞裂解液，參照試劑盒說(shuō)明分別測(cè)

5、定培養(yǎng)上清液和細(xì)胞裂解液中的乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性，計(jì)算細(xì)胞LDH漏出率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：H2O2模型組SH-SY5Y細(xì)胞細(xì)胞膜通透性增加，LDH漏出率顯著增高(P＜0.01)；與模型組相比，給予0.1、1、10mg/L香菇多糖，可抑制細(xì)胞內(nèi)LDH的釋放，明顯降低細(xì)胞LDH漏出率(P＜0.01)。
　　 4．香菇多糖對(duì)H2O2損傷SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)MDA含量和SOD活力的影響

6、　　 收集細(xì)胞裂解液，用考馬斯亮藍(lán)法定細(xì)胞內(nèi)總蛋白量，參照丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxidase dismutase，SOD)檢測(cè)試劑盒說(shuō)明分別測(cè)定細(xì)胞內(nèi)MDA含量、SOD活力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：細(xì)胞經(jīng)H2O2氧化損傷后MDA含量顯著增加（P＜0.01），SOD活力顯著降低(P＜0．01）；經(jīng)香菇多糖0.1、1、10mg/L處理后，細(xì)胞內(nèi)MDA含量顯著減少(P＜0.01），SOD活力顯著

7、增高(P＜0.01）。
　　 5．香菇多糖對(duì)H2O2損傷SH-SY5Y細(xì)胞核形態(tài)的影響
　　 細(xì)胞經(jīng)處理后，室溫下以4％多聚甲醛固定，Hoechst33258染色，在熒光顯微鏡下觀(guān)察并拍照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：細(xì)胞經(jīng)Hoechst33258染色后，正常組細(xì)胞胞核染色均勻；H2O2模型組細(xì)胞胞核內(nèi)可見(jiàn)致密的顆粒狀熒光，呈現(xiàn)出凋亡細(xì)胞典型的核固縮、核斷裂表現(xiàn)；香菇多糖各濃度保護(hù)組細(xì)胞則胞核形態(tài)趨于正常，凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯減少。

8、>　　 6．香菇多糖對(duì)H2O2損傷SH-SY5Y細(xì)胞凋亡率的影響
　　 細(xì)胞經(jīng)處理后，以Annexin V-FITC/PI雙染后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：與正常組比較，H2O2模型組細(xì)胞的凋亡率明顯升高(P＜0.01）；而相對(duì)模型組，香菇多糖各濃度保護(hù)組細(xì)胞的凋亡率降低，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。
　　 7．香菇多糖對(duì)H202損傷SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)Caspase-3蛋白表達(dá)的影響
　　 細(xì)胞