瘤胃纖維降解菌Real-Time PCR熒光定量方法的建立及其初步應(yīng)用.pdf

1、對綿羊瘤胃主要的幾株纖維降解菌如產(chǎn)琥珀酸擬桿菌Fibrobactersuccinogenes、白色瘤胃球菌Rumincoccus albus、黃色瘤胃球菌Rumincoccusflavefacions和瘤胃厭氧真菌的Real-Time PCR熒光定量方法進行研究，獲得如下結(jié)果： 1．DNA的提取采用珠磨-SDS/CTAB/PVP法。提取的瘤胃微生物總DNA在20Kb以上，OD<,260>/OD<,280>在1.7以上，經(jīng)過純化后

2、OD<,260>/OD<,280>均在1.8-2.0，利用真細菌、古細菌和真菌16s/18SrDNA的通用引物從純化后瘤胃微生物總DNA中成功擴增出目標(biāo)條帶，表明珠磨式機械破碎法能充分破碎包括細菌、真菌等在內(nèi)的各種瘤胃微生物，并滿足后續(xù)實驗的要求。 2．以16s/18SrDNA為靶序列，利用SYBR Green Ⅰ熒光染料Real-time PCR法成功對Fibrobacter succinogenes、Rumincoccus

3、albus、Rumincoccusflavefaciens和瘤胃厭氧真菌進行了定量檢測，并構(gòu)建了標(biāo)準品，所建立的標(biāo)準曲線斜率均在-3.0左右，有效檢測靈敏度可達10<'1>水平拷貝/20μL體系。對具體PCR條件進行優(yōu)化后，分別在種和類的水平上，建立了采用SYBR Green Ⅰ熒光染料Real-Time PCR法對瘤胃主要纖維降解菌進行絕對定量的方法，且較為快速和準確。此外還對熒光定量Real-Time PCR法計數(shù)結(jié)果和傳統(tǒng)滾管計數(shù)

4、法進行了相關(guān)性分析，相關(guān)系數(shù)達到了95.9％，證明了此方法在瘤胃纖維降解菌的計數(shù)方面具有較高的優(yōu)越性和實用性。 3．本試驗還利用上述方法研究了不同精粗比日糧條件下瘤胃主要纖維降解菌區(qū)系和數(shù)量的變化。試驗選用9只體況良好、體重50kg左右的蘇尼特綿羊隨機分為三組，每組3只。Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ組精粗比分別為1：9、2：8和5：5。通過應(yīng)用熒光定量Real-time PCR與傳統(tǒng)計數(shù)方法對瘤胃纖維降解菌和厭氧真菌進行計數(shù)，結(jié)果為兩種方法所得結(jié)

5、果具有一致性、變化趨勢相同。傳統(tǒng)方法試驗條件下纖維降解菌群出現(xiàn)顯著增加的趨勢，但是日糧纖維素含量對瘤胃真菌數(shù)量影響不顯著；而利用本試驗所建立的熒光定量Real-time PCR法方法檢測到的結(jié)果可以看出，F(xiàn)ibrobacter succinogenes、Rummococcus flavefaciens和厭氧真菌受日糧粗纖維比例的影響顯著，只有Ruminococcus albus受影響不顯著，但是隨著粗纖維的增加仍具有明顯的增加趨勢。從本