植物轉脂蛋白CaMBP-10結合蛋白的鑒定、克隆和表達.pdf

1、白菜中發(fā)現(xiàn)的小分子堿性蛋白BP-10被證明是一種植物非特異性轉脂蛋白(nsLTPs)，也是一種不依賴于Ca2+的鈣調素結合蛋白。本實驗室的研究證明BP-10參與了植物抗性反應，為進一步確定其可能的作用機制，我們首先通過蛋白組學的方法對與BP-10相互作用的蛋白進行分離鑒定。凝膠覆蓋技術(Gel-overlay)被廣泛應用于蛋白相互作用的研究中，本論文成功建立了堿性小分子蛋白BP-10的膠體金標記，并通過斑點雜交實驗證明方法的可靠性和特異

2、性。通過凝膠覆蓋分析(Gel-overlay)從白菜蛋白粗提液中發(fā)現(xiàn)一個可與BP-10特異性結合的35kD的蛋白條帶，利用Pull-down、免疫共沉淀從白菜粗蛋白提取液中分離了這一蛋白，并對該蛋白條帶進行質譜分析鑒定，確定其是甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)。提取白菜總RNA進行反轉錄，參考GenBank中已登錄的幾種雙子葉植物GAPDH保守區(qū)域，設計簡并引物進行RT-PCR，克隆了GAPDH基因。將獲得的GAPDH基因連接到pE

3、T32M表達質粒，轉化Ecoil.BL21(DE3) TrxB-大腸桿菌，得到可誘導表達GAPDH融合蛋白的菌株。在16℃下用IPTG誘導表達獲得GAPDH融合蛋白，以融合蛋白為研究對象，通過凝膠覆蓋分析、凝膠過濾層析以及Pull-down等方法進一步證明了GAPDH與BP-10存在蛋白相互作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)GAPDH是一種多功能蛋白，不僅在真核生物糖代謝中起重要作用，在一些脅迫條件下，植物GAPDH也表現(xiàn)出一定的脅迫響應。BP-10