結(jié)核分枝桿菌耐藥相關(guān)的雙組份系統(tǒng)的篩選.pdf

1、結(jié)核?。╰uberculosis，TB）是由結(jié)核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）引起的嚴(yán)重危害公眾健康的傳染病，每年新發(fā)的結(jié)核病例數(shù)就超940萬(wàn)例，每年病死人數(shù)也超過(guò)130萬(wàn)。結(jié)核菌耐藥不但給社會(huì)帶來(lái)了極大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)；而且是結(jié)核病擴(kuò)散和蔓延的重要原因。因此，深入研究結(jié)核分枝桿菌的耐藥機(jī)制，尋求新的耐藥診斷和治療靶點(diǎn)，對(duì)于結(jié)核病的防控具有重要意義。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌雙組份系統(tǒng)與細(xì)菌的耐藥，甚至是

2、耐多藥存在密切關(guān)系。而目前尚未有人對(duì)與MTB耐藥相關(guān)的TCS進(jìn)行全面分析。本研究的目的是通過(guò)對(duì)MTB耐多藥菌株和敏感菌株的11個(gè)完整的TCS反應(yīng)調(diào)節(jié)子和2個(gè)TCS孤兒反應(yīng)調(diào)節(jié)子（Orphan Response Regulator）的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，以篩查差異表達(dá)的TCS反應(yīng)調(diào)節(jié)子，并通過(guò)藥物誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)對(duì)差異表達(dá)的TCS反應(yīng)調(diào)節(jié)子進(jìn)行鑒定，以確認(rèn)這些TCS是否對(duì)抗生素刺激敏感，進(jìn)而篩選出可能與MTB耐藥相關(guān)的TCS。本實(shí)驗(yàn)首先將7H9肉湯培養(yǎng)

3、至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行總RNA的提取和鑒定純度；然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，利用SYBR Green定量PCR方法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的雙組份系統(tǒng)的反應(yīng)調(diào)節(jié)子表達(dá)水平。最終篩查出Rv0491、Rv3133c、Rv3143和Rv3246c在耐藥菌株組中的表達(dá)與H37Rv相比平均上調(diào)表達(dá)2.30、5.85、2.88和3.24倍；敏感菌株組與H37Rv相比平均上調(diào)1.09、1.08、0.68和1.10倍，兩組之間存在明顯差異（p<0.05）。其余基因

4、的表達(dá)在耐多藥菌株組、H37Rv和敏感菌株之間沒(méi)有明顯差異（p>0.05）。
　　此外，將L-J培養(yǎng)基培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的結(jié)核分枝桿菌耐藥菌株，轉(zhuǎn)種至7H9肉湯培養(yǎng)基中；然后分別加入耐藥臨界濃度和1/2MIC的INH、RIF、SM、EMB和LFA，進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)72h和7d,結(jié)果顯示在抗生素壓力下，Rv1027c、Rv3246c、Rv3143、Rv0491和Rv3133c的表達(dá)有明顯變化。
　　雙組份系統(tǒng)反應(yīng)調(diào)節(jié)子的表達(dá)檢測(cè)和藥