HCV 1b亞基因組復制子細胞模型的建立及藥物初步篩選.pdf

1、丙型肝炎病毒(HepatitisCVirus，HCV)是丙型肝炎的致病體，丙型肝炎是世界范圍內的重要傳染病之一。據(jù)估計，目前世界上有1.7億多人感染該病毒，占人口總數(shù)的3％。HCV大部分感染者發(fā)展成慢性肝炎，并最終導致肝硬化和肝癌。目前對HCV的預防和治療十分有限，迄今還沒有疫苗問世。對HCV感染者最有效的治療方法為聚乙二醇干擾素聯(lián)合利巴韋林，持續(xù)病毒學應答率對基因型有很強的依賴性，即不同的基因型對治療反應差異很大。此外，其治療費用頗高

2、，且具有顯著的副作用。因此，迫切需要更加有效的治療方法。但是，這方面的研究進展不明顯，主要原因是沒有合適的細胞模型可以有效支持HCV病毒的復制。 直到1999年，復制子模型的出現(xiàn)使HCV細胞模型的研究向前邁了一大步。HCV亞基因組復制子模型使病毒復制子第一次在人源肝癌細胞系中大量復制，成為HCV病毒研究的有效工具。 本研究利用構建成功的中國人群中HCV1b亞基因組復制子質粒，采用體外轉錄的方法獲得HCV1b亞基因組復制子

3、RNA，并通過電穿孔的方法轉染細胞系Huh—7.5.1，經(jīng)過G418藥物篩選6周后，獲得了大量高效復制HCV1b亞基因組復制子的細胞集落。在此工作基礎上，為了篩選到具有穩(wěn)定遺傳和高效復制的細胞單克隆，我們在獲得的細胞集落中，挑選90個單克隆進行單克隆化培養(yǎng)，最終得到三個具有穩(wěn)定遺傳和高效復制的細胞單克隆。本研究運用RT-PCR技術和WesternBlot技術驗證細胞中HCV亞基因組復制子的存在，并且通過Real-TimePCR檢測細胞中

4、HCV亞基因組復制子的拷貝數(shù)，進一步證實了該細胞模型中存在HCV1b亞基因組復制子，并存在大量的拷貝。 與此同時，本研究采用干擾素-α和利巴韋林處理細胞模型，檢測到細胞中HCV亞基因組復制子的拷貝數(shù)明顯下降，成功模擬了藥物篩選的過程，為未來的抗病毒藥物的篩選和評價提供有力的工具和實驗方法。 同時，本研究還通過原核表達體系和昆蟲桿狀病毒表達體系表達HCV非結構蛋白，目的是獲得HCV亞基因組中各非結構蛋白，用于抗病毒機制的研