骨髓基質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞與自體骨髓基質(zhì)干細(xì)胞低氧條件下聯(lián)合培養(yǎng)后的成骨能力特性.pdf

1、目的： 自兔骨髓中分離獲取高純度的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（Bone Marrow Stromal Cells，BMSC）并對(duì)其進(jìn)行體外培養(yǎng)、擴(kuò)增；將部分BMSC向內(nèi)皮細(xì)胞（Endothelial Cells，EC）誘導(dǎo)，并鑒別其表型；觀察低氧條件下BMSC及其來源的EC聯(lián)合培養(yǎng)后，BMSC的增殖情況及體外成骨能力，探討低氧條件下BMSC與其來源的EC聯(lián)合培養(yǎng)對(duì)其體外成骨能力的影響。 方法： 1.兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（BMSC

2、）的分離、培養(yǎng) 利用Percoll分離液（相對(duì)密度1.077）進(jìn)行密度梯度離心法從兔骨髓中分離骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，進(jìn)行體外培養(yǎng)擴(kuò)增。 2.骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞的誘導(dǎo)分化、培養(yǎng)和鑒定 采用細(xì)胞性狀穩(wěn)定的第二代骨髓基質(zhì)干細(xì)胞消化，吹打均勻，更換培養(yǎng)液為內(nèi)皮誘導(dǎo)培養(yǎng)液，兩三天換液持續(xù)誘導(dǎo)，消化傳代后，取細(xì)胞做CD34免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定其內(nèi)皮細(xì)胞表型。 3.MTT法檢測(cè)低氧條件下BMSC與其誘導(dǎo)來源的EC聯(lián)合培養(yǎng)的

3、細(xì)胞增殖及活力 取第二代骨髓基質(zhì)干細(xì)胞與其誘導(dǎo)來源的內(nèi)皮細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分四組：（1）BMSC常氧培養(yǎng)組；（2）BMSC低氧培養(yǎng)組；（3）BMSC+EC常氧聯(lián)合培養(yǎng)組；（4）BMSC+EC低氧聯(lián)合培養(yǎng)組。體外連續(xù)培養(yǎng)7天，分別在此7天內(nèi)用MTT檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖能力，酶標(biāo)儀測(cè)定光密度值（OD值），每個(gè)樣本設(shè)六個(gè)復(fù)孔，求其平均值并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。 4.檢測(cè)低氧條件下BMSC與其誘導(dǎo)來源的EC聯(lián)合培養(yǎng)的成骨能力 取第三代

4、骨髓基質(zhì)干細(xì)胞與其誘導(dǎo)來源的內(nèi)皮細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分四組：（1）BMSC常氧成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)組；（2）BMSC低氧成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)組；（3）BMSC+EC常氧成骨誘導(dǎo)聯(lián)合培養(yǎng)組：（4）BMSC+EC低氧成骨誘導(dǎo)聯(lián)合培養(yǎng)組。96孔板內(nèi)體外連續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)6天，分別在此6天內(nèi)用PNPP法檢測(cè)各組細(xì)胞的堿性磷酸酶（ALP）活性的表達(dá)，酶標(biāo)儀測(cè)定光密度值（OD值），每個(gè)樣本設(shè)五個(gè)復(fù)孔，求其平均值，并繪制ALP活性增長(zhǎng)曲線；6孔板內(nèi)四組樣本體外連續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)7天，在第

5、7天行茜素紅染色，觀察礦化結(jié)節(jié)形成情況。 結(jié)果： 1.密度梯度離心結(jié)合貼壁獲取高純度的BMSC，且較好保持了細(xì)胞的活性，貼壁3天后細(xì)胞成長(zhǎng)梭形及多角形，五六天后增殖迅速，形成細(xì)胞集落。傳代后細(xì)胞形態(tài)更加單一，五六天后即可鋪滿瓶底。 2.由BMSC誘導(dǎo)來源的原代EC培養(yǎng)三天后，細(xì)胞貼壁，五天后明顯集落形成，細(xì)胞成梭形：傳代后，細(xì)胞逐漸變大，由長(zhǎng)梭形變?yōu)槎嘟切?，成典型的“鋪路石”樣?nèi)皮細(xì)胞形態(tài)。傳代后的內(nèi)皮細(xì)胞CD3

6、4免疫細(xì)胞化學(xué)染色為陽性。 3.MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖及活力顯示：第一、二天各組細(xì)胞數(shù)量無明顯增加且統(tǒng)計(jì)學(xué)上各組間細(xì)胞增殖能力沒有顯著性差異（P>0.05）；第三天后，各組細(xì)胞數(shù)量顯著增加，統(tǒng)計(jì)學(xué)上低氧培養(yǎng)組的細(xì)胞增殖能力均明顯高于常氧培養(yǎng)組（P<0.01），但同條件下的BMSC單獨(dú)培養(yǎng)組和BMSC+EC聯(lián)合培養(yǎng)組間的細(xì)胞增殖能力沒有顯著性差異（P>0.05）。 4.PNPP法檢測(cè)各組ALP活性表達(dá)顯示：BMSC+EC

7、低氧成骨誘導(dǎo)聯(lián)合培養(yǎng)組的ALP活性表達(dá)明顯高于其他三組（P<0.05）；BMSC低氧成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)組高于BMSC常氧成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)組（P<0.05）；BMSC+EC常氧成骨誘導(dǎo)聯(lián)合培養(yǎng)組高于BMSC常氧成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)組（P<0.05）；四組樣本培養(yǎng)七天后，BMSC+EC低氧成骨誘導(dǎo)聯(lián)合培養(yǎng)組部分細(xì)胞密集生長(zhǎng)區(qū)有礦化結(jié)節(jié)形成，茜素紅染色呈橘紅色，其他三組未見。 結(jié)論： 1.BMSC可通過密度梯度離心結(jié)合貼壁培養(yǎng)獲得。在一定的體外