腎癌樹(shù)突狀細(xì)胞瘤苗體外抗原負(fù)載的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　腎細(xì)胞癌是最常見(jiàn)的腎臟惡性腫瘤。腎癌早期無(wú)癥狀，出現(xiàn)癥狀時(shí)，約有60％的患者發(fā)生了難以預(yù)料的轉(zhuǎn)移。目前，根治性腎癌切除術(shù)是治療的主要手段，但手術(shù)僅能治療早期患者，對(duì)大部分腎癌患者并不能達(dá)到“根治”的目標(biāo)。腎癌對(duì)放療和化療均不敏感，以往的病例對(duì)照研究顯示放、化療及激素治療均不能阻止腎癌的臨床過(guò)程。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，腎癌是一種免疫原性很強(qiáng)的腫瘤，免疫治療對(duì)腎癌有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。而腫瘤特異性主動(dòng)免疫治療是一種激發(fā)機(jī)體特異性抗腫

2、瘤免疫反應(yīng)的策略，是最具前景的腎癌治療手段。樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cell, DC)瘤苗是國(guó)內(nèi)外腫瘤特異性主動(dòng)免疫治療研究和應(yīng)用的前沿和焦點(diǎn)。DC是目前已知的功能最強(qiáng)大的專(zhuān)職抗原遞呈細(xì)胞(antigen presenting cell，APC)，也是唯一能激活初始型T細(xì)胞的APC。DC的抗原遞呈功能是DC瘤苗抗腫瘤免疫治療的基礎(chǔ)。而DC瘤苗尚需完善的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是如何成功地進(jìn)行DC瘤苗的體外腫瘤抗原負(fù)載。熱休克蛋白70(heat-

3、shock proteins70，HSP70)是細(xì)胞質(zhì)中的一種“分子伴侶”(molecular chaperones)，其基因組成及氨基酸序列具有高度保守性，同種間不具多態(tài)性，在腫瘤細(xì)胞內(nèi)有較高的表達(dá)，具有“伴移抗原肽”（chaperone antigenicpeptides）作用，其本身雖不是腫瘤抗原，但作為一種載體，結(jié)合多種腫瘤抗原肽（抗原決定簇），從腫瘤組織中提取的HSP70，實(shí)際上，是結(jié)合了腫瘤肽庫(kù)的熱休克蛋白70-肽復(fù)合物（h

4、eat-shock proteins70-peptide complexes，HSP70-PC）。如果我們從腎癌中提取具有黑箱概念的HSP70-PC做為腎癌的腫瘤抗原，進(jìn)行DC的體外抗原負(fù)載，即能改善腫瘤患者DC功能的不足，又避免了全細(xì)胞性抗原等的負(fù)面作用，必將獲得更好的治療效果，具有良好的應(yīng)用前景。同時(shí)，由于HSP70同種間不具多態(tài)性，同種腫瘤可能存在相同腫瘤抗原，從腎癌組織或細(xì)胞株中提取的HSP70-PC可用于那些不能手術(shù)、無(wú)法獲取

5、腫瘤抗原的晚期患者，使他們能夠進(jìn)行DC療法治療，最大程度地延長(zhǎng)患者生存期和生存質(zhì)量。定會(huì)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益，意義重大。
　　方法：
　　1、DC的體外培養(yǎng)
　　采集自愿者外周靜脈肝素鈉抗凝血，經(jīng)Ficoll-Paque Plus密度梯度離心獲得PBMC，用PBS液洗滌二次，懸浮于AIM-V無(wú)血清培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞濃度在5×106/ml，在37℃，5％CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2h后去除懸浮細(xì)胞，貼壁細(xì)胞加

6、入含有1000 u/ml GM-CSF和1000 u/ml IL-4的AIM-V無(wú)血清培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，第2d、第5d補(bǔ)加細(xì)胞因子，于第7d加入腫瘤抗原，第8d收獲DC，流式細(xì)胞儀檢測(cè)DC表面成熟標(biāo)志CD83、CD80、CD86、HLA-DR的表達(dá)，并進(jìn)行接續(xù)的實(shí)驗(yàn)。
　　2、HSP70-PC的層析分離及鑒定
　　將腎癌組織細(xì)胞置于約4倍體積的低滲緩沖液（30mM NaHCO3，pH7.2）中超聲破碎，20，000 rpm高

7、速離心2h，取上清過(guò)Con A-Sephrose柱，收集未結(jié)合組分，PD-10柱更換緩沖液A(20 mM Tris-HCL，20 mM NaCl，15 mMβ-巰基乙醇，3mMMgCl2，pH7.5)，然后將樣品加到ADP-agarose柱上，結(jié)合部分用含有3mMADP的緩沖液A進(jìn)行洗脫，將洗脫液用PD-10柱更換為緩沖液B(20 mM Tris-HCl，20mM NaCl，pH7.5)，再加于DEAE纖維素柱，用FPLC系統(tǒng)進(jìn)行分離，

8、20～500 mM梯度NaCl洗脫。將各色譜柱分離的樣品及DEAE纖維素柱的各段洗脫峰樣品在10％SDS-PAGE上進(jìn)行蛋白質(zhì)分子量及純度測(cè)定，電泳后進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色，或轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，進(jìn)行免疫印跡(Western blot)分析。BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。
　　3、腎癌組織的原代培養(yǎng)
　　腎細(xì)胞癌腫瘤標(biāo)本置DMEM培養(yǎng)基（含1％青霉素/鏈霉素，1％兩性霉素，0.5％谷氨酰胺，20％胎牛血清）。用不同的原代組織培養(yǎng)方

9、法培養(yǎng)。1～2代以后部分細(xì)胞用細(xì)胞凍存液保存于液氮中。殺瘤實(shí)驗(yàn)以第3代傳代細(xì)胞為靶細(xì)胞。
　　4、HSP70-PC致敏DC與自體T細(xì)胞共培養(yǎng)
　　外周靜脈抗凝血經(jīng)Ficoll-Paque Plus密度梯度離心獲得PBMC后，在CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中經(jīng)2h靜止后傾出的懸浮細(xì)胞，離心，加入細(xì)胞凍存液，調(diào)整細(xì)胞濃度1.0×107/ml，-80℃凍存。第7d復(fù)蘇，分裝培養(yǎng)瓶，按1∶10的比例分別加入HSP70-PC等不同組別致敏DC細(xì)胞

10、，3d后收集細(xì)胞。
　　5、T細(xì)胞殺瘤活性檢測(cè)
　　用自體原代培養(yǎng)的腎癌細(xì)胞為靶細(xì)胞，共培養(yǎng)3d的T細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，效靶比20∶1，孵育24 h后用CCK-8試劑盒進(jìn)行CTL殺瘤活性檢測(cè)。
　　結(jié)果：
　　1、DC的體外培養(yǎng)
　　貼壁的PBMC經(jīng)加入含GM-CSF、IL-4的無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)1d后開(kāi)始出現(xiàn)少數(shù)細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)。第3d細(xì)胞出現(xiàn)不規(guī)則形態(tài)，懸浮細(xì)胞增多。第5d細(xì)胞表面伸出毛刺樣突起，數(shù)量增多，體積增

11、大，成簇生長(zhǎng)。第7d大部分細(xì)胞懸浮并聚集成簇，外形不規(guī)則，體積為原來(lái)的1～2倍，具有典型的樹(shù)突狀突起。外周血單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)GM-CSF、IL-4誘導(dǎo)可大致獲得5～10％PBMC數(shù)量的DC。加入腫瘤裂解物抗原及誘導(dǎo)成熟因子或加入自體或異體的HSP70-PC后，DC表面成熟標(biāo)志CD83、CD80、CD86、HLA-DR的表達(dá)明顯增加。
　　2、HSP70-PC的純化及鑒定
　　經(jīng)過(guò)二次親和層析和DEAE纖維素柱的分離后，得到純度

12、較高的分子量約為70 kDa的蛋白質(zhì)，經(jīng)免疫印跡分析證實(shí)該蛋白質(zhì)即為HSP70。經(jīng)BCA法測(cè)定溶液中HSP70-PC濃度計(jì)算，大約每1 g腫瘤組織細(xì)胞可獲得20～100μg的HSP70-PC。HSP70-PC體外致敏DC無(wú)需再加入促DC成熟的細(xì)胞因子，就能使DC表面成熟標(biāo)志CD83、CD80、CD86、HLA-DR的表達(dá)增加，具有更好的活化DC的能力。
　　3、腎癌組織的原代培養(yǎng)
　　8例腎癌患者切除的腫瘤標(biāo)本經(jīng)不同原代培養(yǎng)

13、方法均成功分離出腎癌細(xì)胞并能傳代培養(yǎng)及復(fù)蘇?；旌厦赶ńY(jié)合差速貼壁分離法是較適合的腎癌原代培養(yǎng)方法。這些原代培養(yǎng)細(xì)胞足夠用于體外CTL特異性殺瘤試驗(yàn)的檢測(cè)。最終用于檢測(cè)殺瘤實(shí)驗(yàn)的5例。
　　4、抗原致敏DC誘導(dǎo)的CTL殺瘤活性
　　原代培養(yǎng)腎癌細(xì)胞患者自體抗原致敏DC誘導(dǎo)的CTL殺傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HSP70-PC致敏DC組所誘導(dǎo)的CTL具有更高的殺傷自體腫瘤的能力。4種效應(yīng)細(xì)胞組（T細(xì)胞）殺傷率從低至高依次為:未經(jīng)DC誘導(dǎo)

14、組、無(wú)抗原致敏DC組、腫瘤細(xì)胞提取物抗原致敏DC組、HSP70-PC致敏DC組，各組間殺傷率相關(guān)性分析顯示，各組間差異均顯著(P＜0.01)，各組之間殺傷率比較具有正相關(guān)關(guān)系。原代培養(yǎng)腎癌細(xì)胞患者用異體抗原（腎癌769-P細(xì)胞株HSP70-PC）致敏DC誘導(dǎo)的CTL殺傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，異體HSP70-PC致敏的DC也較無(wú)腫瘤細(xì)胞提取物抗原致敏的DC所誘導(dǎo)的CTL具有更高的殺傷腫瘤的能力。原代培養(yǎng)腎癌細(xì)胞患者自體HSP70-PC致敏DC誘導(dǎo)

15、的CTL與原代培養(yǎng)腎癌細(xì)胞患者異體HSP70-PC抗原致敏的DC誘導(dǎo)的CTL殺瘤活性比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　結(jié)論：
　　(1)從外周血單個(gè)核細(xì)胞中能夠成功分離、擴(kuò)增出樹(shù)突狀細(xì)胞。在體外培養(yǎng)中，腎癌細(xì)胞裂解物抗原體外致敏外周血單個(gè)核細(xì)胞來(lái)源的DC需要促DC成熟細(xì)胞因子的輔助誘導(dǎo)才能使DC成熟。
　　(2)應(yīng)用色譜分離法可以有效地提取純度較高的HSP70-PC。提純的HSP70-PC有較好的體外致敏D