ARHI基因對A2780細胞及裸鼠移植瘤生長抑制作用的研究.pdf

1、背景：
　　 據中山大學相關統(tǒng)計分析研究，目前我國女性卵巢癌發(fā)病率高達6.1/10萬，約占卵巢腫瘤總數的5％。雖然我國卵巢癌發(fā)病率低于歐洲、北美等發(fā)達國家，但據統(tǒng)計分析目前我國香港、廣州和上海等沿海大城市發(fā)病率明顯高于內地中心城市，而且生活富足地區(qū)的女性發(fā)病率明顯增高，可能與飲食中高脂肪高蛋白攝取有關，尤其是食物中動物脂肪含量高有關。因此近年來，我們與發(fā)達國家間卵巢癌的發(fā)病率差距逐漸減小。卵巢癌中卵巢原發(fā)性癌的比例約占90％-9

2、5％，另外5％-10％為其他部位原發(fā)的癌轉移至卵巢。由于卵巢癌早期臨床癥狀少且不典型，缺乏特異性，同時門診篩查有限，導致其早期診斷較困難，約70％左右的患者就診時已為晚期。因此，雖然卵巢癌的發(fā)病率僅位于婦科惡性腫瘤第三位，低于官頸癌和子宮內膜癌，但其死亡率卻超過宮頸癌和子宮內膜癌之和，高居婦科癌癥首位，嚴重威脅婦女健康。所以，早期發(fā)現是卵巢癌治療的關鍵。探索卵巢癌早期敏感標志物，同時利用生物學治療是目前卵巢癌研究的熱點。
　　

3、卵巢癌的發(fā)生包括多基因、多階段相互作用的復雜過程。癌基因的激活和抑癌基因的失活是腫瘤生長的決定因素。ARHI基因是近年來發(fā)現的抑癌基因之一，其在正常乳腺、卵巢、胰腺組織中均高表達。我們2006年前期試驗結果表明在卵巢腫瘤中ARHI基因表達下調，在卵巢癌中缺失率高達67％。國內外相關研究也表明ARHI參與了胰腺癌、乳腺癌及卵巢癌的發(fā)生發(fā)展。
　　 目前對于晚期卵巢癌的治療，手術往往達不到滿意效果，甚至無法行手術治療，需依賴輔助化療

4、。隨著化療藥物廣泛應用，卵巢癌的耐藥嚴重影響療效。因此逆轉卵巢癌耐藥是目前研究熱點。
　　 目的：
　　 建立ARHI基因轉染穩(wěn)定表達的卵巢癌耐藥細胞株A2780/DDP，觀察轉染前后ARHI基因的表達;探討ARHI基因轉染對裸鼠A2780/DDP移植瘤的生長抑制作用，研究順鉑對裸鼠荷瘤生長的影響;探討ARHI基因轉染對A2780細胞周期及侵襲轉移能力的影響。
　　 第一部分：ARHI基因在A2780細胞中的表達

5、及意義
　　 方法:常規(guī)培養(yǎng)人上皮性卵巢癌細胞系A2780及A2780/DDP，應用RT-PCR和Westernblot方法測定ARHI在兩種細胞系內的基因和蛋白表達。構建ARHI基因的真核表達質粒pEGFP-C1-ARHI，以脂質體介導法轉染體外培養(yǎng)的人卵巢癌細胞株A2780、A2780/DDP，同時轉染空載體pEGFP-C1質粒，以未轉染細胞為對照;轉染后細胞株分別命名為ARHI/A2780、ARHI/A2780/DDP，p

6、EGFP-C1/A2780和pEGFP-C1/A2780/DDP。應用RT-PCR、Westernblot方法分析ARHI基因及其蛋白表達。應用T檢驗A2780及A2780/DDP兩種細胞中ARHI基因差別。應用秩和檢驗對比研究A2780及A2780/DDP轉染前后目的基因的差別，同時橫向對比轉染后ARHI/A2780組、ARHI/A2780/DDP組目的基因的差別。所有結果均以P小于0.05作為臨界值。
　　 結果:
　

7、　 1、ARHI基因在A2780和A2780/DDP細胞株中表達
　　 應用RT-PCR及Westernblot分別檢測ARHI基因在A2780及A2780/DDP中mRNA及蛋白表達，結果顯示ARHI存在低表達和缺失。RT-PCR檢測A2780細胞株可發(fā)現ARHI弱表達，平均表達水平為0.027±0.01，A2780/DDP表達缺失。Wsesternblot檢測A2780組蛋白表達，A2780/DDP組無蛋白表達。應用配對T

8、檢驗檢測轉染前后A2780、A2780/DDP細胞ARHI基因mRNA及蛋白表達，兩組差異具有顯著性(p＜0.05)。
　　 2、ARHI基因在ARHI/A2780、ARHI/A2780/DDP細胞株中表達
　　 ARHI基因轉染穩(wěn)定表達的A2780，A2780/DDP細胞株，利用RT-PCR及Westernblot檢測ARHI基因mRNA及蛋白表達，結果顯示:ARHI/A2780組、ARHI/A2780/DDP組ARH

9、ImRNA表達均為陽性，平均表達水平分別為0.086±0.01，0.081±0.01;A2780空質粒轉染組也可檢測到ARHI基因mRNA表達，表達水平為0.029±0.01。A2780/DDP空質粒轉染組無ARHI基因及蛋白表達。對比轉染穩(wěn)定ARHI/A2780及ARHI/A2780/DDP細胞株，兩者轉染后差異無顯著性(P＞0.05)。
　　 結論:
　　 1、ARHI基因在A2780、A2780/DDP細胞中低表達

10、或缺失，ARHI基因與卵巢癌細胞耐藥有關。
　　 2、利用脂質體介導ARHI質粒轉染真核細胞，可得到穩(wěn)定表達的細胞克隆，轉染成功后可提高目的基因的表達。
　　 第二部分：ARHI基因對裸鼠A2780/DDP移植瘤生長抑制作用的研究
　　 方法:穩(wěn)定轉染的ARHI/A2780/DDP組，pEGFP-C1/A2780/DDP組和A2780/DDP組三組細胞系，在裸鼠右前肢根部皮下（腋窩）注射種植;觀察ARHI對A27

11、80/DDP裸鼠移植瘤成瘤能力的影響。利用westernblot方法檢測裸鼠移植瘤體內ARHI表達。應用順鉑小劑量單藥化療干預各組瘤細胞種植裸鼠，順鉑作用途徑分兩組腹腔注射、尾靜脈注射。觀察順鉑對裸鼠移植瘤體生長的影響。
　　 結果:
　　 1、ARHI基因對A2780/DDP裸鼠移植瘤成瘤能力的影響
　　 ARHI/A2780/DDP組、pEGFP-C1/A2780/DDP組和A2780/DDP組細胞傳代，于裸

12、鼠腋窩皮下注射。接種10-12天后觀察pEGFP-C1/A2780/DDP(n=8)組和A2780/DDP(n=8)組所有裸鼠均成瘤，成瘤率達100％，瘤體體積在100mm3左右，觀察瘤體生長速度較快。ARHI/A2780/DDP(n=8)組接種后，12天內僅1只裸鼠腋下有瘤體生成，但瘤體體積在30mm3，30天左右僅有3只裸鼠瘤體生成，早期瘤體增大至50mm3，后期兩瘤體體積很小，肉眼觀察較困難。
　　 2、ARHI基因在A2

13、780/DDP裸鼠移植瘤內的表達
　　 裸鼠移植瘤體成瘤穩(wěn)定后5-7天，處置各組裸鼠，應用westernblot檢測各組瘤體內ARHI差異，結果顯示:ARHI/A2780/DDP組瘤體可見明顯ARHI表達，pEGFP-C1/A2780/DDP組和A2780/DDP組ARHI低表達或缺失。秩和檢驗發(fā)現ARHI/A2780/DDP組與空載體轉染組及未轉染組相比差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。pEGFP-C1/A2780/DDP組和

14、A2780/DDP組之間無明顯差別。
　　 3、ARHI基因轉染聯合順鉑對裸鼠移植瘤生長影響
　　 分別應用順鉑腹腔注射和尾靜脈注射兩種方法作用于三組裸鼠，觀察7天，處置裸鼠，解剖裸鼠腋窩及腹腔。結果顯示:順鉑作用后瘤體生長速度明顯減慢。ARHI/A2780/DDP組、pEGFP-C1/A2780/DDP組和A2780/DDP組瘤體均有不同程度的變性壞死，瘤體體積及重量較基礎體積及重量降低。ARHI/A2780/DDP組

15、與其余兩組間差異顯著(p＜0.05)。三組裸鼠處死后均未見明顯腹腔轉移，無明顯腹水形成。腹腔注射組與尾靜脈注射組兩者之間無顯著差異(p＞0.05)。
　　 結論:
　　 1、ARHI基因穩(wěn)定轉染可以抑制裸鼠體內A2780/DDP移植瘤的形成及生長。
　　 2、ARHI基因轉染聯合順鉑治療可明顯抑制A2780/DDP移植瘤的生長。
　　 第三部分：ARHI基因對A2780/DDP細胞周期和侵襲能力的影響

16、r>　　 方法:轉染穩(wěn)定的三組細胞系ARHI/A2780/DDP，pEGFP-C1/A2780/DDP和A2780/DDP，穩(wěn)定傳代，分別針對細胞生長及侵襲機制進行如下研究:流式細胞儀PI染色方法檢測ARHI基因和空載體轉染對卵巢癌細胞株細胞周期的影響。應用MTT和生長曲線分析ARHI基因對卵巢癌細胞增殖的影響。流式細胞儀PI染色檢測ARHI基因對卵巢癌細胞凋亡的影響。應用細胞劃痕試驗檢測ARHI基因對卵巢癌細胞遷移的影響。應用Wws

17、ternblot方法檢測ARHI基因對PI3K/AKT信號轉導通路和死亡相關蛋白激酶1(DAPK1)的影響。
　　 結果:
　　 1、ARHI基因對A2780/DDP細胞周期的影響
　　 應用流式細胞儀PI染色方法檢測ARHI/A2780/DDP組、pEGFP-C1/A2780/DDP組和A2780/DDP組細胞周期的變化，結果顯示:停滯于G1期細胞由A2780/DDP的51％，pEGFP-C1/A2780/DD

18、P的55％上升至ARHI組的69％。統(tǒng)計學分析ARHI組與空載體及未轉染兩組比較差異顯著(p＜0.05)，A2780/DDP組、pEGFP-C1/A2780/DDP組之間無顯著差異(p＞0.05)。
　　 2、ARHI基因對A2780/DDP細胞增殖的影響
　　 應用MTT檢測ARHI/A2780/DDP、pEGFP-C1/A2780/DDP和A2780/DDP三組細胞細胞增殖能力，結果顯示:在第5天時檢測A2780/D

19、DP組及空載體組細胞較第一天增長5-6倍，ARHI組僅增長3倍左右。統(tǒng)計學分析ARHI組與其余兩組差異顯著。A2780/DDP組，空載體組無明顯差異。
　　 3、ARHI基因對A2780/DDP細胞凋亡的影響
　　 應用流式細胞儀PI染色檢測A2780/DDP細胞轉染前后凋亡率，結果顯示:細胞凋亡率在A2780/DDP組、空載體組分別為11.1％、11.7％，ARHI組為29.9％。ARHI轉染顯著增加腫瘤細胞凋亡率(p

20、＜0.05)。
　　 4、ARHI基因對A2780/DDP細胞遷移的影響
　　 應用細胞劃痕試驗檢測A2780/DDP細胞轉染前后遷移能力，結果顯示:細胞遷移率在A2780/DDP組，空載體組無顯著差異，但ARHI組細胞遷移率顯著減慢(p＜0.05)。
　　 5、ARHI基因對A2780/DDP細胞PI3K/AKT信號轉導通路和死亡相關蛋白激酶1(DAPK1)的影響
　　 應用westernblot方法檢

21、測三組細胞株中磷酸化AKT的表達，結果證實ARHI組P-AKT蛋白表達下調。在ARHI轉染組中DAPK1蛋白表達比A2780/DDP組、空載體組上調。統(tǒng)計學分析ARHI轉染組與其余兩組差別具有顯著意義。
　　 結論：
　　 1、ARHI基因使A2780/DDP細胞停滯于G1期，抑制細胞增殖，增強細胞凋亡，減緩細胞的侵襲性。
　　 2、ARHI基因通過增加P-AKT蛋白及DAPK1蛋白表達，阻斷PI3K/AKT信號