PAQR3過(guò)表達(dá)對(duì)氧糖剝奪再灌注損傷的保護(hù)作用及其可能機(jī)制.pdf

1、第一章，氧糖剝奪再灌注后高爾基體蛋白PAQR3的表達(dá)變化
　　目的:
　　探討氧糖剝奪再灌注后細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞活性、細(xì)胞凋亡以及高爾基體蛋白PAQR3的表達(dá)變化。
　　方法:
　　以小鼠來(lái)源神經(jīng)瘤母細(xì)胞N2a細(xì)胞為研究對(duì)象，經(jīng)歷氧糖剝奪再灌注后，采用倒置光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性，流式雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，并應(yīng)用Real-time PCR和Western blot技術(shù)分別檢測(cè)PAQR3的mRNA和蛋

2、白表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.細(xì)胞形態(tài)的變化:氧糖剝奪4小時(shí)再灌注12小時(shí)及24小時(shí)后，細(xì)胞形態(tài)明顯受損，貼壁能力減弱，細(xì)胞之間的間隙增大，折光性降低，胞體輪廓模糊，突起減少或消失，細(xì)胞縮小變圓，部分死亡崩解的細(xì)胞抱團(tuán)懸浮于培養(yǎng)液中。
　　2.細(xì)胞活性的變化:與正常組比較，氧糖剝奪4小時(shí)再灌注0小時(shí)和4小時(shí)細(xì)胞活性出現(xiàn)下降，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);而再灌注12小時(shí)和24小時(shí)，與正常組比較，細(xì)胞活性明顯下

3、降(P＜0.05)。
　　3.細(xì)胞凋亡率的變化:氧糖剝奪4小時(shí)再灌注4小時(shí)、12小時(shí)和24小時(shí)，細(xì)胞的凋亡率明顯增高，與正常組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　4.PAQR3 mRNA的表達(dá)變化:與正常組相比，氧糖剝奪4小時(shí)再灌注0小時(shí)與4小時(shí)PAQR3 mRNA的表達(dá)明顯減少(P＜0.05);再灌注12小時(shí)和24小時(shí)，PAQR3的mRNA表達(dá)進(jìn)一步減少，與正常組比較，具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。

4、r>　　5.PAQR3的蛋白表達(dá)變化:與正常組相比，氧糖剝奪4小時(shí)再灌注0小時(shí)，PAQR3的蛋白表達(dá)稍有減少，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);而再灌注4小時(shí)、12小時(shí)和24小時(shí)，PAQR3的蛋白表達(dá)明顯減少(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.氧糖剝奪再灌注導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)受損、活性下降，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
　　2.氧糖剝奪再灌注下調(diào)高爾基體蛋白PAQR3的表達(dá)。
　　第二章，小鼠PAQR3真核表達(dá)載體的構(gòu)建及

5、表達(dá)
　　目的:
　　構(gòu)建小鼠PAQR3真核表達(dá)質(zhì)粒并驗(yàn)證其在N2a細(xì)胞中的表達(dá)。
　　方法:
　　從Genebank找到小鼠PAQR3基因全長(zhǎng)序列，通過(guò)人工化學(xué)合成，裝載于表達(dá)載體CMV-MCS-EGFP-SV40-Neomycin，大量擴(kuò)增后進(jìn)行PCR鑒定和測(cè)序證實(shí)其正確性。將鑒定正確的重組質(zhì)粒利用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染N2a細(xì)胞，并采用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率、MTT法評(píng)估PAQR3過(guò)表達(dá)對(duì)N2a細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的影響、R

6、eal-time PCR和Western blot技術(shù)分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中PAQR3的基因和蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　成功構(gòu)建了小鼠PAQR3真核表達(dá)質(zhì)粒，并利用脂質(zhì)體法成功轉(zhuǎn)染N2a細(xì)胞，經(jīng)熒光顯微鏡檢測(cè)，轉(zhuǎn)染后72小時(shí)轉(zhuǎn)染效率最高;MTT法檢測(cè)顯示，與正常細(xì)胞和空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比，PAQR3過(guò)表達(dá)對(duì)N2a細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線無(wú)明顯影響;Real-time PCR和Western blot技術(shù)檢測(cè)顯示轉(zhuǎn)染細(xì)胞株中PAQR3

7、的基因和蛋白明顯高表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　成功構(gòu)建小鼠PAQR3真核表達(dá)質(zhì)粒并在N2a細(xì)胞中高表達(dá)。
　　第三章，PAQR3過(guò)表達(dá)對(duì)氧糖剝奪再灌注損傷的保護(hù)作用及其可能機(jī)制
　　目的:
　　研究PAQR3過(guò)表達(dá)在氧糖剝奪再灌注損傷中的作用并探討其可能機(jī)制。
　　方法:
　　將構(gòu)建成功的PAQR3真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染N2a細(xì)胞，經(jīng)歷氧糖剝奪再灌注后，采用倒置光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性

8、，流式雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率的變化;選取細(xì)胞形態(tài)、活性、凋亡率變化最顯著的時(shí)間點(diǎn)，應(yīng)用Real-time PCR檢測(cè)ERK1、ERK2和AKT的mRNA表達(dá);Western blot技術(shù)檢測(cè)PAQR3、ERK1/2、AKT、GSK3β和對(duì)應(yīng)的磷酸化蛋白p-ERK1/2(Thr202/Tyr204)、p-AKT(Ser473)、p-GSK3β(Ser9)蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.PAQR3真核質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，經(jīng)氧糖剝奪4

9、小時(shí)再灌注12及24小時(shí)后，與空載體組相比，細(xì)胞形態(tài)受損明顯減輕，細(xì)胞活性增高(P＜0.05)，凋亡率下降(P＜0.01)。
　　2.PAQR3真核質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，經(jīng)氧糖剝奪4小時(shí)再灌注12及24小時(shí)后，與空載體組相比，ERK1、ERK2和AKT的mRNA表達(dá)無(wú)顯著差異(P＞0.05)。
　　3.正常細(xì)胞經(jīng)氧糖剝奪4小時(shí)再灌注24小時(shí)后，與未OGD組相比，p-ERK1/2(Thr202/Tyr204)的表達(dá)明顯增多(P＜0.

10、05); PAQR3真核質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，經(jīng)氧糖剝奪4小時(shí)再灌注24小時(shí)后，與空載體組相比，PAQR3穩(wěn)定高表達(dá)，p-ERK1/2(Thr202/Tyr204)的表達(dá)顯著減少(P＜0.05)。
　　4.正常細(xì)胞經(jīng)氧糖剝奪4小時(shí)再灌注24小時(shí)后，與未OGD組相比，p-AKT(Ser473)的表達(dá)顯著增多(P＜0.05)，p-GSK3β(Ser9)的表達(dá)顯著減少(P＜0.05); PAQR3真核質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，經(jīng)氧糖剝奪4小時(shí)再灌注24