重組人雌激素受體基因酵母細(xì)胞對(duì)家畜尿液中雌激素類藥物殘留的檢測(cè)研究.pdf

1、動(dòng)物性食品中雌激素類藥物殘留對(duì)人類健康造成損害，同時(shí)還影響到環(huán)境和畜牧業(yè)可持續(xù)健康發(fā)展，并引起了廣泛的關(guān)注。目前，檢測(cè)雌激素類藥物殘留的檢測(cè)方法主要有氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)，酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)等。這些方法有其優(yōu)點(diǎn)，也有其局限性，都存在對(duì)檢測(cè)操作人員、精密檢測(cè)儀器要求高，對(duì)待測(cè)樣品有一定的純度要求，受檢測(cè)場(chǎng)地等因素限制等缺點(diǎn)，不適用于常規(guī)動(dòng)物食品安全監(jiān)督。因此，建立簡(jiǎn)便、快速、有效的動(dòng)物體內(nèi)雌激素類藥物殘

2、留檢測(cè)方法顯得尤其重要。
　　目的：本文構(gòu)建了重組人雌激素受體(hER)基因酵母細(xì)胞(W303-1A/hER-ERE-LacZ，W303-1A/hER-ERE-yEGFP)，W303-1A/hER-ERE-Lac Z是一種酵母細(xì)胞傳感器，其LacZ報(bào)告基因受hER的調(diào)控，當(dāng)雌激素類藥物與hER結(jié)合時(shí)，會(huì)使LacZ基因的表達(dá)產(chǎn)物β-半乳糖苷酶大量升高，通過(guò)測(cè)其活性，可以監(jiān)測(cè)尿液中雌激素類藥物的含量，特別適合基層單位開(kāi)展日常的監(jiān)測(cè)工作

3、;而W303-1A/hER-ERE-yEGFP是一種發(fā)光酵母細(xì)胞，通過(guò)測(cè)其發(fā)光度，檢測(cè)尿液中雌激素類藥物的含量，不需添加任何試劑，具有快速簡(jiǎn)便的特點(diǎn)。構(gòu)建方法和應(yīng)用如下:
　　材料與方法:(1)將受雌激素效應(yīng)元件調(diào)控的pMP206/ERE和pLZ-yEGFP載體用醋酸鋰(LiAC)方法，分別轉(zhuǎn)化于可表達(dá)雌激素受體(hER)的酵母細(xì)胞，經(jīng)SD/-trp，-ura選擇性培養(yǎng)板，篩選出陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，并對(duì)其進(jìn)行PCR鑒定，從而構(gòu)建成受雌激素

4、調(diào)控的Lac Z基因酵母細(xì)胞和yEGFP發(fā)光酵母細(xì)胞，分別命名為W303-1A/hER-ERE-Lac Z和W303-1 A/hER-ERE-yEGFP，并將其劃線接種于SD/-trp，-ura選擇平板上，于30℃培養(yǎng)出克隆;(2)從重組基因酵母培養(yǎng)板挑取單個(gè)酵母克隆，于酵母培養(yǎng)液30℃振蕩培養(yǎng)活化，并用酵母細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋3倍;(3)從規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)采集犢牛、懷孕母牛尿樣計(jì)22份，采集不同階段仔豬和母豬尿樣計(jì)78份，分別經(jīng)過(guò)濾、水解、C1

5、8柱吸附、用三氯甲烷洗脫、經(jīng)二甲基亞砜處理定容處理;(4)取0.010 mL甲基亞砜定容液分別作用于W303-1A/hER-ERE-Lac Z和W303-1A/hER-ERE-yEGFP細(xì)胞，30℃振蕩作用6h，分別測(cè)β-半乳糖苷酶的活性或細(xì)胞的發(fā)光強(qiáng)度。用雌二醇（己烯雌酚、炔雌醇）作為陽(yáng)性對(duì)照，蒸溜水作為試劑空白對(duì)照。
　　結(jié)果:兩種重組基因酵母細(xì)胞對(duì)所有的加標(biāo)（雌二醇、己烯雌酚、炔雌醇）均呈陽(yáng)性結(jié)果。用W303-1A/hER-

6、ERE-Lac Z測(cè)定，雌二醇的檢出限為10-12mol/L，懷孕母牛、犢牛、仔豬和不同時(shí)期母豬的尿樣中的雌激素類化合物與空白對(duì)照比較無(wú)顯著性差異(P＞0.05);仔豬與不同時(shí)期母豬尿樣中雌激素化合物未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);用W303-1 A/hER-ERE-yEGFP研究發(fā)現(xiàn)，雖然懷孕母牛尿樣中的雌激素化合物高于犢牛，但經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，而仔豬與不同時(shí)期母豬尿樣中的雌激素化合物濃度很低，低于W303-1

7、A/hER-ERE-yEGFP細(xì)胞的檢出限水平（＜10-9 mol/L雌二醇當(dāng)量）。
　　結(jié)論:(1)該方法可檢測(cè)已知和未知的具有雌激素樣作用的化合物或藥物，具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏等特點(diǎn)，適合大量樣本的基層初級(jí)篩選;(2)該方法樣品對(duì)象為尿液，相對(duì)于其他樣品，采集比較方便，并能實(shí)現(xiàn)活體檢測(cè)，可在降低畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測(cè)成本的同時(shí)，對(duì)畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管實(shí)行及時(shí)有效預(yù)警;(3)本文所采集的樣品均來(lái)自規(guī)模化養(yǎng)殖企業(yè)，飼養(yǎng)比較規(guī)范，未在飼料中