木犀草素、葒草苷和異葒草苷的UGT代謝機理及BCRP外排轉運蛋白調控其代謝的機制研究.pdf

1、研究背景和目的:
　　 來源于植物的天然產(chǎn)物在預防和治療疾病方面發(fā)揮著重要的作用。約有20％的中草藥中含有具有抗癌、抗氧化等多種藥理活性的黃酮類化合物，但是目前大多數(shù)黃酮類化合物還沒有被開發(fā)成化學預防或治療藥物。造成黃酮類化合物無法有效應用的主要原因是這類化合物在體內極低的生物利用度(＜10％)。Ⅱ相代謝酶中的葡萄糖醛酸轉移酶(UGTs)引起的首過效應是其生物利用度低的重要原因之一。深入的研究這類化合物的UGT代謝機理，對黃酮類

2、藥物的開發(fā)有重要的意義。黃酮類化合物在體內處置過程中，外排轉運蛋白和代謝酶共同起著重要作用。一方面化合物進入細胞內被代謝酶所代謝，代謝產(chǎn)物由于極性增高無法通過被動擴散排出細胞;另一方面外排轉運蛋白(如P-gp、BCRP、MRPs)能夠將代謝產(chǎn)物外排出細胞，使代謝反應能夠繼續(xù)進行。抑制外排轉運蛋白能夠降低代謝產(chǎn)物在腸道和肝臟中的清除率，增加其在體循環(huán)中的累積量，造成藥物毒性或是發(fā)揮更好的藥理效果。綜合考察代謝和外排兩種因素對黃酮類化合物處

3、置的影響，了解可以控制代謝的因素，對克服黃酮類化合物生物利用度屏障有重要的意義。
　　 本文選擇了一種典型的黃酮類化合物木犀草素及兩種碳苷黃酮作為模型化合物研究UGT代謝機理和外排轉運蛋白對代謝的調控機制。木犀草素是一種多酚類黃酮化合物，在5、7、3'、4'位連接羥基，廣泛存在于苔蘚植物、蕨類植物、被子植物中，在日常飲食如胡蘿卜、胡椒、芹菜、橄欖油中也大量存在。葒草苷和異葒草苷是以木犀草素為母體，6、8位通過碳碳鍵與葡萄糖相連的

4、碳苷黃酮，廣泛分布于淡竹葉、葒草、三色堇、金蓮花等傳統(tǒng)中藥中。研究發(fā)現(xiàn)木犀草素、葒草苷和異葒草苷均具有保護心血管、抗氧化、抗炎、抗腫瘤等藥理作用。
　　 葒草苷和異葒草苷代謝研究極少，木犀草素在體內易被代謝成為葡萄糖醛酸代謝產(chǎn)物，被排出腸道而無法發(fā)揮藥理作用。在我們的前期實驗中發(fā)現(xiàn)木犀草素可被UGT代謝，代謝產(chǎn)物是外排轉運蛋白BCRP的底物。因此深入的研究木犀草素UGT代謝機理和外排轉運蛋白對其代謝的影響有利于我們全面的了解木犀

5、草素在體內的處置情況，為增加其生物利用度，使其成為可供臨床應用的制劑提供重要的理論依據(jù)。
　　 本文中我們通過體外藥物代謝研究方法確定三種化合物的UGT代謝產(chǎn)物，探討其UGT代謝機理。更重要的是通過考察在高表達UGT1 A9的Hela細胞系中UGT1A9對木犀草素的代謝作用以及代謝產(chǎn)物的外排特征來探討B(tài)CRP外排轉運蚩白對UGT代謝的調控機制。
　　 實驗方法與結果:
　　 1.木犀草素、葒草苷和異葒草苷UGT代

6、謝機理研究
　　 1.1木犀草素、葒草苷和異葒草苷UGT代謝產(chǎn)物的鑒定
　　 我們通過LC/MS/MS和HRMS對木犀草素、葒草苷和異葒草苷的葡萄糖醛酸代謝產(chǎn)物的結構進行了確證。結果顯示葒草苷和異葒草苷在體外葡萄糖醛酸化代謝體系中分別產(chǎn)生了兩個單葡萄糖醛酸結合產(chǎn)物。木犀草素在體外葡萄糖醛酸化代謝體系中可以產(chǎn)生六個葡萄糖醛酸代謝產(chǎn)物，其中三個為單葡萄糖醛酸代謝產(chǎn)物(M1，M2，M3)，葡萄糖醛酸結合位點分別為7，4'，3'

7、位，三個為雙葡萄糖醛酸代謝產(chǎn)物(M5，M-2G, M6)。雙葡萄醛酸代謝產(chǎn)物中的M-2G根據(jù)水解實驗推測葡萄糖醛酸結合位點為4'，3'位。
　　 1.2 UGT1A及UGT2B家族對木犀草素、葒草苷和異葒草苷的代謝研究
　　 為了闡明參與木犀草素、葒草苷和異葒草苷代謝的主要UGT isoform，我們運用重組人源化UGT亞酶與木犀草素、葒草苷和異葒草苷在10μM的濃度下進行孵育，計算每分鐘每毫克蛋白代謝產(chǎn)物的生成速率。我

8、們發(fā)現(xiàn)木犀草素在含有UGT isoform的二相反應體系中孵育30 min只能檢測到五個葡萄糖醛酸代謝產(chǎn)物，包括兩個雙葡萄糖醛酸代謝產(chǎn)物(M-2G, M6)和三個單葡萄糖醛酸代謝產(chǎn)物(M1，M2，M3)。對所有的酶亞型，代謝產(chǎn)物M1，M3的生成量最多，是最主要的葡萄糖醛酸代謝產(chǎn)物。UGT1A9是產(chǎn)生M-2G最多的酶亞型，UGT1A7次之，UGT1A1，UGT1 A8，UGT1A10也能夠代謝產(chǎn)生M-2G。UGT1A1是產(chǎn)生M6最多的酶亞

9、型，UGT1A3，UGT1 A4，UGT1 A6，UGT1A7, UGT1A8，UGT1A10,UGT2B7也能夠代謝木犀草素生成M6。UGT1A9同時也參與了M1，M2和M3的生成，并且是生成代謝產(chǎn)物最多的一種亞酶。UGT2B家族對木犀草素的二相代謝的參與較少，UGT1A9，UGT1A1，UGT1 A8是代謝木犀草素最重要的UGT亞酶。葒草苷在含有UGT isoform的二相反應體系檢測到兩個葡萄糖醛酸代謝產(chǎn)物(M1, M2)。UGT

10、1A1，UGT1A7，UGT1A8，UGT1A10參與了M1的生成，UGT1A8是代謝生成M2的重要酶亞型。異葒草苷在含有UGT isfor的二相反應體系也檢測到兩個葡萄糖醛酸代謝產(chǎn)物(M1，M2)。其中UGT1A10是生成M1的主要酶亞型;UGT1A1和UGT1A10是生成M2的主要酶亞型。
　　 1.3人、大鼠肝微粒體對木犀草素、葒草苷、異葒草苷的酶代動力學研究
　　 為了能夠能全面的了解木犀草素、葒草苷和異葒草苷的

11、葡萄糖醛酸化代謝特征，我們使用了人、大鼠肝微粒體(Pooled human liver microsomes，HLM; Poolrat liver microsomes，RLM)反應體系來研究木犀草素、葒草苷和異葒草苷的酶代動力學特征。結果顯示三種化合物的酶代動力學基本上符合Michaelis-Menten酶動學模型，無論是在HLM或RLM反應體系中，木犀草素的代謝速率都較其它兩種化合物高。木犀草素產(chǎn)生7位葡萄糖醛酸代謝產(chǎn)物的Vmax最

12、高。RLM對葒草苷的代謝速率較HLM快，而RLM和HLM代謝異葒草苷的Vmax相似。
　　 2.BCRP外捧對木犀草素UGT代謝的調控機制研究
　　 2.1 UGT1A9抑制實驗和M-2G生成的時間依賴性考察
　　 為了研究UGT1A9是否在HLM對木犀草素的二相代謝中發(fā)揮著主要的作用，我們選擇了UGT1A9的化學特異性抑制劑香芹酚，以孵育體系中不含香芹酚作為對照，通過對相同酶濃度的HLM和UGT1A9催化木犀草

13、素產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的減少量，來判斷在HLM的代謝中UGT1A9是否起著主要的作用。結果顯示200μM香芹酚使木犀草素在人肝微粒體孵育體系中代謝產(chǎn)物M-2G, M，M2，M3的產(chǎn)生量分別降低了27.8％，44.3％，17.6％，53.2％;200μM香芹酚使木犀草素在UGT1A9孵育體系中代謝產(chǎn)物M-2G, M1，M2，M3的產(chǎn)生量分別降低了68.9％，59.8％，34.6％，79.2％，香芹酚對UGT1A9和HLM代謝的抑制都呈濃度依賴性。

14、UGT1A9在HLM代謝木犀草素中發(fā)揮著重要的作用。
　　 為了更好的了解UGT1A9代謝木犀草素生成M-2G的特征，我們考察了UGT1 A9催化生成M-2G的時間依賴性。在木犀草素的濃度為10μM，UGT1A9的終濃度為0.265 mg/ml時，M-2G的生成量隨著時間的增加而增加，具有時間依賴性。
　　 2.2 Hela-UGT1A9中UGT1 A9的蛋白表達水平和Hela-UGT1A9 cell lysate與UG

15、T1 A9的酶代動力學實驗
　　 UDP-Glucuronosyltransferase(UGT)1A9-Overexpressing HeLa細胞系簡稱為Hela-UGT1 A9，是一種經(jīng)過轉染可以穩(wěn)定表達UGT1 A9的Hela細胞系。這種細胞系同時高表達一種重要的外排轉運蛋白BCRP，適用于研究外排轉運蛋白和UGT代謝酶相互作用對藥物處置的影響。蛋白免疫印跡法考察Hela-UGT1 A9細胞系中UGT1 A9的表達水平，結

16、果顯示該細胞系能夠高表達UGT1 A9。比較Hela-UGT1 A9 cell lysate和UGT1A9的酶代動力學特征來研究Hela-UGT1A9細胞系是否是適合于研究木犀草素UGT1A9代謝的模型。Cell lysate中UGT1A9的蛋白量經(jīng)過校正后，Hela-UGT1A9 cell lysate的酶代動力學參數(shù)Km，Vmax與UGT1A9相似。
　　 2.3木犀草素在Hela-UGT1A9細胞模型上的代謝與外排特征研究

17、
　　 在本實驗室的培養(yǎng)條件下，將Hela-UGT1 A9種于六孔培養(yǎng)板中，經(jīng)過3-4天培養(yǎng)，用于實驗研究。采用此細胞模型分別考察了木犀草素1μM、2μM、5μM、10μM、20μM、40μM在Hela-UGT1A9細胞模型中的代謝外排特征。結果顯示木犀草素在Hela-UGT1A9細胞模型上能迅速被代謝成葡萄糖醛酸代謝產(chǎn)物并排出細胞外。木犀草素三個單葡萄糖醛酸代謝產(chǎn)物M1，M2，M3的外排速率隨著底物濃度增加而增加，當?shù)孜餄舛葹?/p>

18、5μM時，外排速率達到最大，當?shù)孜餄舛瘸^20μM時外排速率有明顯的下降。隨著木犀草素底物濃度的增加，代謝產(chǎn)物細胞內的累積量呈現(xiàn)增加的趨勢，代謝產(chǎn)物的細胞清除率CL有顯著的下降，F(xiàn)met值下降。
　　 2.4 BCRP對木犀草素在Hela-UGT1 A9細胞模型上UGT代謝的調控機制研究
　　 我們考察了BCRP專屬性抑制劑Ko143對木犀草素在Hela-UGT1 A9細胞上代謝和外排的影響。BCRP的濃度為5、10μM

19、，木犀草素的濃度為2、10、40μM。Ko143能夠顯著降低木犀草素代謝產(chǎn)物的外排速率，并且使細胞內代謝產(chǎn)物的累積量增加。在木犀草素底物濃度為10μM，Ko143濃度為5μM時在細胞內檢測到了雙葡萄糖醛酸代謝產(chǎn)物(M-2G)。在木犀草素底物濃度為40μM時，在不存在Ko143時細胞內也能夠檢測到雙葡萄糖醛酸代謝產(chǎn)物，且隨著Ko143濃度的增大，細胞內雙葡萄醛酸代謝產(chǎn)物的量顯著增加。Ko143對單葡萄糖醛酸代謝產(chǎn)物細胞內總量的影響顯示其能

20、夠使細胞內單葡萄糖醛酸代謝產(chǎn)物的總量顯著增加。而Ko143對單葡萄糖醛酸代謝產(chǎn)物細胞外和細胞內單葡萄糖醛酸代謝產(chǎn)物總量的影響則顯示同一底物濃度時Ko143對單葡萄糖醛酸代謝產(chǎn)物細胞內外總量的影響很小。5μM的Ko143對三個濃度的木犀草素的Fmet沒有產(chǎn)生影響，10μM的Ko143對Fmet產(chǎn)生的影響也很有限。當木犀草素底物濃度是10μM時，5和10μM的Ko143能夠顯著的降低代謝產(chǎn)物的清除率;當木犀草素底物濃度是40μM時，10μM

21、 Ko143能夠顯著降低代謝產(chǎn)物的清除率。
　　 結論:
　　 1.我們首次在體外發(fā)現(xiàn)了木犀草素的三個雙葡萄糖醛酸代謝產(chǎn)物，初步確定了其中一個雙葡萄糖醛酸代謝產(chǎn)物的結合位點。深入的研究了三種化合物的UGT代謝機理，為提高其生物利用度及臨床應用前研究提供基本的理論基礎和示范性指導。
　　 2.UGT代謝和BCRP的外排的偶聯(lián)作用是木犀草素生物利用度低的重要原因。當細胞內單葡萄糖醛酸代謝產(chǎn)物的量增加或是BCRP被抑制