雌激素對人視網膜色素上皮ARPE-19細胞氧化應激的保護作用.pdf

1、目的： 探討雌激素對藍光及過氧化氫誘導的人視網膜色素上皮ARPE-19細胞內活性氧生成以及細胞死亡的保護作用，并觀察雌激素對氧化誘導的Akt活化及其下游效應蛋白Bad磷酸化的影響，以探討Akt/Bad通路在雌激素抗氧化機制中發(fā)揮的作用。 方法： (1)對離體培養(yǎng)的人視網膜色素上皮ARPE-19細胞接種于12孔板后分為對照組、E2組和ICI+E2組：對照組無藥物處理、E2組予10nM、100nM、1μM E2預處理

2、2h、ICI+E2組予雌激素受體拮抗劑ICI1827801μM聯合10nM E2共同處理2h，以藍光照射(2000±500Lx，470±20nm)或過氧化氫(H2O2，200uM)作氧化處理，在氧化處理前(0時相)以及氧化處理后30min、1h、2h、4h以2'7'-二氯熒光乙酰乙酸鈉(DCFH-DA)檢測細胞內ROS熒光強度； (2)ARPE-19細胞接種于96孔板或6孔板，分為空白對照組(氧化-，藥物-)、陰性對照組(氧化+

3、，藥物-)、E2組和ICI+E2組。E2組予10nM、100nM、1μM E2預處理2h，ICI+E2組予1μM ICI182780聯合10nM、100nM、1μME2共同預處理2h，以藍光照射(2000±500Lx，470±20nm)或H2O2，400uM作氧化處理12h。以MTT比色法檢測細胞活性變化、以Hoechst染色以及Annexin V FITC-PI雙染流式細胞術法檢測細胞凋亡； (3)ARPE-19細胞接種于6孔

4、板，以Western Blot免疫印跡法檢測：1)10nM E2處理后0、30min、1h、3h、6h、12h、24h時間點的P-Akt表達；2)比較10nME2、1μM ICI182780+10nM E2處理后0、1h、3h、6h時間點的P-Akt表達；3)比較對照組和E2組(10nM E2預處理24h)在接受藍光照射(2000±500Lx，470±20nm)或200uM H2O2處理后0、30min、1h、2h時間點的P-Akt、P

5、-Bad表達；4)比較對照組、E2組(10nM E2預處理24h)、ICI+E2組(1μM ICI182780+10nM E2預處理24h)在0時相、藍光照射(2000±500Lx，470±20nm)后1 h、H2O2(200μM)處理后30min的P-Akt表達。 結果： (1)藍光照射和過氧化氫均可顯著增強ARPE-19細胞內的ROS熒光，提示藍光照射和過氧化氫處理均成功誘導氧化應激，10nM、100nM、1uM17

6、β-雌二醇劑量依賴性地減低藍光照射和過氧化氫處理后ARPE-19細胞內的ROS熒光增強的幅度，1μICI182780能阻斷10nM E2對藍光照射誘導ROS生成的抑制作用，但不能阻斷10nME2對過氧化氫誘導ROS生成的抑制作用； (2)10nM、100nM、1uM17β-雌二醇可減弱以藍光照射和H2O2處理建立的實驗氧化應激模型對ARPE-19活性的影響，降低細胞的凋亡率和死亡率。10nM17β-雌二醇這一保護作用可被1μMI

7、CI182780阻斷； (3)10nM17β-雌二醇能誘導ARPE-19細胞一過性的p-Akt表達；10nM17β-雌二醇預處理24小時能使藍光照射和H2O2處理誘導的P-Akt、P-Bad表達顯著增強。1uM ICI182780可阻斷10nM17β-雌二醇誘導的一過性P-Akt表達以及對藍光照射和H2O2處理誘導的P-Akt表達的增強作用。 結論： 雌激素17β-雌二醇能通過依賴或非依賴雌激素受體的方式減少藍光