腦膜炎大腸桿菌K1株新基因cglE的克隆、表達及功能研究.pdf

1、細菌性腦膜炎是中樞神經系統(centralnervesystem，CNS)最常見最嚴重的感染性疾病。盡管抗生素的廣泛使用，但細菌性腦膜炎的發(fā)病率仍有5％-40％，而幸存者神經系統后遺癥的發(fā)生率高達30％。細菌性腦膜炎的高感染率和死亡率的主要原因之一是由于其發(fā)病機制還不清楚。 大腸桿菌(EscherichiacoliE.coli)是導致新生兒腦膜炎最常見的革蘭氏陰性桿菌。已知大部分發(fā)生在新生兒中的細菌性腦膜炎是細菌血源性傳播的結果

2、。進入中樞神經系統是細菌性腦膜炎發(fā)生的必要條件，但關于血循環(huán)中的大腸桿菌如何穿透由腦微血管內皮細胞(brainmicrovascularendothelialcells，BMECs)等組成的血腦屏障(blood-brainbarrier,BBB)，其機制仍待研究。目前在腦膜炎大腸桿菌感染組學的研究中，已經確定部分基因與細菌穿透血腦屏障有關。通過TnphoA突變實驗發(fā)現基因ibeA在細菌侵襲BMEC過程中發(fā)揮著重要作用，且為毒力株E.co

3、liK1株所獨有的。包含著ibeA的基因島命名為GimA(aGeneticislandofmeningiticE.colicontainingibeA)。GimA全長20.3kb，其GC含量(46.2％)與Ecoli基因組的GC含量(50.8％)不同，含有4個操縱子，分別是ptnIPKC,cglDTEC，gcxKRCI和ibeRAT，共15個基因。該基因島是由美國南加州大學醫(yī)學院洛杉磯兒童醫(yī)院黃勝和教授發(fā)現并命名，通過信息學預測該基因島

4、編碼10個參與代謝通路的酶，3個轉運蛋白，1個調節(jié)蛋白和1個侵襲素(IbeA)。其中對細菌穿透血腦屏障起關鍵作用的ibeA基因已為黃教授及本實驗室研究報道。在其它14個新基因中，位于第二個操縱子cglDTEC(GimA2)上的第三個基因為cglE，有文獻報道它與很多物種的二氫硫辛酰胺脫氫酶(dihydrolipoamidedehydrogenase，DLDH)有同源性。為了進一步闡明新基因cglE的功能，我們克隆和表達了該基因編碼產物，

5、并通過相關軟件及數據庫對其進行分析預測，并用實驗方法對其功能進行初步驗證。 首先通過生物信息學分析CglE的生物學功能發(fā)現，該蛋白含有Pyr、FAD、Lpd、NADH等結構域，而這些結構域是很多物種的二氫硫辛酸脫氫酶(DLDH)共有的。隨后對CglE與其它六個菌株來源的DLDH進行蛋白序列比對發(fā)現，CglE與它們有較高同源性，尤其是在N端。另外我們還發(fā)現CglE與IbeA蛋白序列的同源性達50％，用DNASTAR分析其的二級結構

6、發(fā)現這兩個蛋白的親水疏水基團、表面可及性都很接近。這些預測為我們功能研究提供方向。 隨后我們對cglE進行克隆表達獲得純化的CglE蛋白。設計合成引物，利用PCR的方法從文庫質粒中擴增出cglE片段，并連接于T載體上；雙酶切法獲得cglE片段，連接于經同樣酶切的表達載體pET22b(+)。重組表達載體鑒定正確后開始蛋白表達，SDS-PAGE電泳結果顯示CglE蛋白是一分子量約為50,000Dalton的蛋白，與軟件預測一致。利用

7、Western-blot的方法，用抗His單克隆抗體驗證表達的蛋白為目的蛋白。通過對表達條件進行優(yōu)化，最終發(fā)現在細菌培養(yǎng)到OD600=0.6時開始對蛋白進行誘導，添加IPTG終濃度為1mmol/L，27℃誘導4hr后蛋白表達產量最高。通過對蛋白可溶性分析，發(fā)現目的蛋白基本以包涵體形式存在于沉淀中。對包涵體洗滌后用8mol/L尿素進行溶解，嘗試幾種不同的復性方法，最后采用稀釋復性的方法，并在復性液中添加甘油，使變性的蛋白得以復性并保持穩(wěn)定

8、性。經過His·Bind親和層析方法獲得純化的CglE蛋白，試劑盒測定其濃度為0.458mg/ml。 純化的蛋白首先用于硫辛酰氨脫氫酶的酶活性測定。利用還原型輔酶Ⅰ(NADH)在340nm處有強吸收峰，用分光光度法測量NADH在340nm處吸光度，可指示出酶反應的進程改變，初步判斷反應是否進行，進而說明是否具有酶活性。本實驗以商品化的硫辛酰氨脫氫酶為陽性對照，確定酶反應的體系；以與CglE有較高同源性的IbeA為陰性對照，分別測

9、定NADH在340nm處吸光度。以時間(min)為橫坐標，A340為縱坐標繪制圖標，結果顯示添加了CglE能使NADH在340處的吸光度逐漸下降，而添加IbeA則無此變化，提示CglE具有二氫硫辛酰氨脫氫酶的活性。 通過Western-blot方法對CglE蛋白抗原性分析發(fā)現，CglE能與IbeA的多克隆抗體結合，提示它們擁有相似的抗原決定族。另外我們用FarWestern-blot的方法發(fā)現CglE能與IbeA結合蛋白(IBP

10、50v)結合。有研究表明IbeA是通過配體受體間的結合而激活信號傳導通路從而輔助細菌穿透血腦屏障，利用噬菌體肽庫所篩選出來的HP-12短肽即是IbeA結合肽。我們通過ELISA實驗發(fā)現這個結合肽也能與CglE特異性結合，提示CglE很可能與IbeA有共同的受體，它們可能通過同一條信號傳導通路作用于細菌的侵襲活動。 關于CglE在細菌侵襲腦微血管內皮細胞中所起的作用，仍需要通過研究缺失cglE的突變菌株的毒力來說明。利用SOE的P