小干擾RNA下調(diào)熱休克蛋白70對A549細(xì)胞增殖與凋亡的影響.pdf

1、背景
　　肺癌是全球發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤。國際癌癥研究中(InternationalAgencyforResearchonCancer，IARC)最新發(fā)布的2014年《世界癌癥報告》中指出，2012年全球罹患癌癥的1410萬人中，肺癌患者高達(dá)180萬并導(dǎo)致159萬人死亡，給人類健康帶來極大危害。熱休克蛋白70(Heatshockprotein70，HSP70)是機(jī)體受到應(yīng)激刺激后產(chǎn)生的一類高度保守的蛋白質(zhì)，參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)蛋

2、白的折疊、保護(hù)細(xì)胞免受應(yīng)激損傷等過程。研究發(fā)現(xiàn)，HSP70在肺癌組織中的表達(dá)量高于正常組織。c-jun氨基末端激酶(c-junN-terminalkinase，JNK)是促分裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activatedproteinkinase，MAPK)超家族的成員之一，應(yīng)激刺激能夠促使其激活并參與細(xì)胞凋亡。研究證實(shí)，誘導(dǎo)產(chǎn)生的HSP70能夠通過影響JNK的活化水平來抑制細(xì)胞凋亡。
　　該課題利用小干擾RNA(Small

3、interferenceRNA，siRNA)下調(diào)A549細(xì)胞HSP70的表達(dá)，觀察細(xì)胞的增殖活性和凋亡率的變化，檢測HSP70、p-JNK和活化型Caspase-3的表達(dá)量，探討HSP70在A549細(xì)胞增殖與凋亡中的作用機(jī)制。
　　方法
　　1實(shí)驗(yàn)方法
　　1.1siRNA的篩選:設(shè)置Mock組、NC組、HSP70-1586組、HSP70-2009組和HSP70-2280組，其中Mock組只加轉(zhuǎn)染試劑，NC組轉(zhuǎn)染NC-

4、siRNA，其余3組分別轉(zhuǎn)染HSPA1A-1586、HSP70-2009和HSPA1A-2280。24h后，進(jìn)行RT-PCR和Real-TimePCR，篩選出沉默效果最好的siRNA。
　　1.2HSP70表達(dá)下調(diào)對A549細(xì)胞的影響:分別設(shè)置Mock組、NC組和實(shí)驗(yàn)組。其中實(shí)驗(yàn)組用篩選出的沉默效果最好的siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
　　1.2.1細(xì)胞增殖活性檢測:轉(zhuǎn)染12h后進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)，分別在轉(zhuǎn)染后12h、24h、36h和48

5、h檢測OD492。
　　1.2.2Westernblot:轉(zhuǎn)染48h后，收集細(xì)胞并提取蛋白，進(jìn)行Westernblot實(shí)驗(yàn)，以β-actin作為內(nèi)參，用QuantityOne軟件分析蛋白的相對表達(dá)量。
　　1.2.3細(xì)胞凋亡率的檢測:轉(zhuǎn)染48h后，將細(xì)胞消化下來制成單細(xì)胞懸液，用Annexin-V-FITC和PI處理細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞的凋亡率。
　　2統(tǒng)計方法:采用SPSS21.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，均數(shù)

6、的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法或Dunnett法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。
　　結(jié)果
　　1siRNA對HSPA1AmRNA的干擾效果:HSPA1A-2009對HSPA1AmRNA的抑制效果最好。
　　2HSP70表達(dá)下調(diào)對A549細(xì)胞增殖活性的影響:與Mock組相比，轉(zhuǎn)染后24h、36h和48h，HSPA1A-2009組細(xì)胞增殖活性均下降（均P＜0.05）。
　　3Westernblot:HSPA

7、1A-2009組HSP70表達(dá)水平低于Mock組和NC組(均P＜0.05)。HSPA1A-2009組的p-JNK表達(dá)量低于Mock組和NC組（均P＜0.05）。HSPA1A-2009組活化型Caspase-3表達(dá)量低于Mock組和NC組（均P＜0.05），NC組活化型Caspase-3表達(dá)量高于Mock組(P＜0.05)。
　　4HSP70表達(dá)下調(diào)對A549細(xì)胞凋亡率的影響:HSPA1A-2009組細(xì)胞凋亡率高于NC組和Mock組