Livin mRNA反義寡核苷酸對人肝癌細胞株HepG-2體外增殖及凋亡的影響.pdf

1、目的: 觀察結(jié)合于Livin mRNA的BIR結(jié)構(gòu)域上的反義寡核苷酸(antisense oligodexynucleotide,ASODN)對Livin基因的抑制效應,及對人類肝癌細胞株HepG-2體外增殖和凋亡的影響。期望觀察到理想的抑瘤效果,為針對Livin基因的反義治療策略及臨床抗腫瘤藥物開發(fā)提供新的思路。
　　 方法:
　　 從genbank上查得livin mRNA的序列,并找出其中的BIR結(jié)構(gòu)域,基于最小自

2、由能原理算法分析出livin mRNA上的低結(jié)合自由能區(qū)域,并針對這一區(qū)域合成反義寡核苷酸ASODN及其對照組錯義寡核苷酸(missense oligodexynucleotide,MSODN),其中反義鏈(Antisense strand)是與Livin mRNA的BIR結(jié)構(gòu)域20個堿基序列互補的反義寡核苷酸片段,錯義鏈(Missensestrand)與Livin mRNA無配對關(guān)系,且不與任何人類已知基因互補。根據(jù)作用藥物不同,實驗

3、可分為ASODN組(處理藥物為ASODN)、MSODN組(處理藥物為MSODN)和對照組(處理藥物為無抗生素無血清的DMEM培養(yǎng)基)。上述藥物作用于人肝癌細胞株HepG-2,采用MTT法檢測Livin ASODN對HepG-2細胞的增殖抑制作用,倒置顯微鏡、透射電子顯微鏡、HE染色、瑞式-姬姆薩染色、流式細胞儀(FCM)以及吖啶橙/溴化乙錠(AO/EB)細胞染色法檢測細胞形態(tài)學改變和細胞凋亡水平;AMV一步法RT-PCR檢測livin

4、mRNA水平；免疫細胞化學方法檢測livin蛋白表達水平。
　　 結(jié)果:
　　 1.HepG-2細胞增殖受抑,且抑制效應與寡核苷酸濃度、作用時間呈量效及時效關(guān)系。
　　 2. livin mRNA及蛋白表達水平下降,細胞出現(xiàn)凋亡。
　　 結(jié)論:
　　 1.ASODN能抑制livin基因的表達,在體外能抑制肝癌細胞增殖。
　　 2.對于較短的mRNA,利用最小自由能原理對其設(shè)計反義核酸是一種