SOD檢測在中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病診斷中的意義及青蒿琥酯干擾作用機制探討.pdf

1、研究背景和目的: 中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病（certral nervous system leukernia，CNSL）的診斷由于大多數(shù)化療藥物難以通過血腦屏障，使隱藏在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的白血病細胞不能被有效清除，成為白血病復(fù)發(fā)的主要原因之一。CNSL可在疾病的各個時期出現(xiàn)，但常發(fā)生在治療后緩解期，急性白血病在起病時較少合并CNSL，但如果沒有采用有效的預(yù)防措施，不但CNSL發(fā)生率高，而且預(yù)后差。陳懿建等[13]報道CNSL的發(fā)病率約為1

2、0～20%，其中急性淋巴細胞白血病并CNSL發(fā)生率為26～30%，急性非淋巴細胞白血病并CNSL發(fā)生率為5～18%。由于預(yù)防CNSL措施的采用，急性髓系白血病的CNS復(fù)發(fā)率已經(jīng)下降至5～10%，急性淋巴細胞白血病的CNS復(fù)發(fā)率降至2～10%[14]。故及時發(fā)現(xiàn)和治療CNSL可以提高患者的生存率和治愈率。目前中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病的診斷標準[15]如下：1.有中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀和體征（尤其是顱內(nèi)壓增高的癥狀和體征）。2.有腦脊液的改變：（1）壓

3、力增高（>0.02kPa或200mmH2O）。（2）白細胞數(shù)>0.01×109/L。（3）涂片見到白血病細胞。（4）蛋白>450mg/L，或潘氏試驗陽性。3.排除其他原因造成的中樞神經(jīng)系統(tǒng)或腦脊液的相似改變。符合條件3加2中的（3）或其他任兩項者可診斷CNSL。無癥狀但有腦脊液改變者可診斷為CNSL。若只有腦脊液壓力持續(xù)升高，但經(jīng)抗CNSL治療后腦脊液壓力下降、恢復(fù)正常者可診斷CNSL。有癥狀無腦脊液改變者，如有腦神經(jīng)、脊髓或神經(jīng)根受累

4、的癥狀和體征?？膳懦渌蛩?，且經(jīng)抗CNSL治療后癥狀有明顯改善者可診斷為CNSL。CNSL起病具有隱匿性，早期的臨床表現(xiàn)多不典型，甚至無陽性癥狀和體征。CNSL臨床表現(xiàn)主要有下列類型：①顱內(nèi)壓增高；②顱神經(jīng)損害：③脊髓損害；④腦實質(zhì)浸潤；⑤神經(jīng)根及周圍神經(jīng)損害。據(jù)研究，在光學(xué)顯微鏡下每微升腦脊液（cerebrospinal fluid，CSF）中能看到1個白血病細胞時，CSF中就存在105個白血病細胞[16]。此時，CNSL已發(fā)展

5、到較嚴重程度，失去早期治療的機會。故早期診斷和預(yù)防CNSL很重要。目前早期診斷CNSL的指標和方法很多，但臨床上尚無特異性和敏感性兼顧的方法。腦脊液細胞學(xué)檢查對CNSL早期診斷有重要價值，但CSF細胞學(xué)檢查只有在白血病細胞浸潤腦膜時呈陽性，而早期浸潤腦實質(zhì)和周圍神經(jīng)的CSF的改變不明顯，甚至陰性，單純依靠CSF細胞學(xué)早期診斷CNSL較困難。因此尋找CNSL新的早期診斷指標對預(yù)防和治療CNSL，提高患者的生存率和治愈率具有重要的臨床意義。

6、目前大多數(shù)實驗研究表明腦腫瘤患者血清中SOD活性增高[32]，是否可通過檢測腦脊液中的SOD活性輔助診斷CNSL有待研究。 CNSL的治療現(xiàn)狀：目前對CNSL的治療主要是顱內(nèi)放療、鞘內(nèi)注射化療藥物和全身化療，這些治療方法雖然可使患者生存期延長，但由于放療、化療副作用大，且多數(shù)藥物難以通過血腦屏障，而多次腰椎穿刺會增加患者痛苦，患者生活質(zhì)量下降，同時多次腰椎穿刺也會使穿刺失敗率增加。這給我們提出了尋找能通過血腦屏障治療CNSL的

7、新藥的課題。 青蒿琥酯研究現(xiàn)狀：青蒿琥酯為蒿素素的衍生物，青蒿素作為中藥青蒿中的抗瘧疾成分，是從菊科植物青蒿中提取的一種含有過氧基團的倍半萜內(nèi)酯化合物，是我國發(fā)現(xiàn)的第一個被國際公認的天然藥物，其高效、低毒、脂溶性好、抗瘧活性高的藥理特性[17-19]使之成為世界范圍的抗瘧疾首選藥。在青蒿素抗瘧作用原理的啟發(fā)下，國內(nèi)外不少實驗室研究青蒿素用于抗腫瘤的可能性，結(jié)果證實了青蒿素及其衍生物有確切的抗腫瘤作用，且青蒿素類藥物抗腫瘤具有選擇

8、性，能選擇性地抑制腫瘤細胞的體外生長，誘導(dǎo)凋亡，抑制增殖，如白血病細胞、纖維肉瘤細胞、卵巢癌細胞、乳腺癌細胞和宮頸癌細胞。其結(jié)構(gòu)新穎、抗腫瘤機制與傳統(tǒng)藥物不同，與傳統(tǒng)藥物不存在交叉耐藥，這些特性使其具有抗多種腫瘤細胞、毒性低、可能逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞的多藥耐藥[20]等優(yōu)勢，本課題根據(jù)青蒿素及其衍生物對腫瘤細胞的殺傷作用和能透過血腦屏障而進入腦組織的藥代動力學(xué)特性[21]，推測青蒿琥酯有可能可以用于治療CNSL，成為CNSL治療的新藥。本研究組

9、在前期的實驗中驗證了青蒿琥酯誘導(dǎo)K562細胞凋亡與鐵代謝有關(guān)，機制考慮可能為青蒿琥酯與鐵反應(yīng)生成自由基而殺死癌細胞。而青蒿素類藥物能夠透過血腦屏障，且口服青蒿素類藥物比起化療藥物以及放療毒副作用小、方便、經(jīng)濟，如能證實 CNSL患者的發(fā)病以及青蒿素類藥物誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡與自由基的變化有關(guān)，那么，對應(yīng)用青蒿素類藥物治療CNSL有重要的臨床意義。 基于以上情況，本研究旨在通過檢測抗氧化物之一 SOD活性在CNSL患者腦脊液中的變化，

10、以及SOD活性等抗氧化標志物在青蒿琥酯誘導(dǎo)K562細胞凋亡過程中的變化，探討SOD檢測在CNSL診斷中的意義及青蒿琥酯干擾作用機制。研究方法 （一）實驗材料： 1.收集2008年1月到2009年1月南方醫(yī)院血液科30例中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病患者腦脊液標本作為實驗組，25例無中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害的急性白血病患者腦脊液標本作為對照組。 2.人慢粒急變K562細胞株在含10%小牛血清的PRMI-1640培養(yǎng)液中，于37℃、5%

11、CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)傳代，每24～36h傳代一次，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。根據(jù)本研究組前期的預(yù)實驗結(jié)果，選擇青蒿琥酯作用濃度為4×10-5mol/L、2×10-4mol/L、1×10-3mol/L三個濃度組，未加青蒿琥酯組為對照組進行實驗。 （二）實驗方法 1.腦脊液常規(guī)、生化及細胞涂片分析。 2.黃嘌呤氧化酶法檢測腦脊液SOD活性。 3.AnnexinⅤ-PI雙染和Hochest33258檢

12、測不同濃度處理組青蒿琥酯誘導(dǎo)的K562細胞凋亡情況。 4.黃嘌呤氧化酶法檢測不同濃度處理組青蒿琥酯誘導(dǎo)K562細胞凋亡時SOD活性。 5.實時熒光定量PCR檢測MnSOD、SeGPx mRNA的表達。 6.統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，獨立樣本t檢驗（Independent-Samples T Test）、單項方差分析（One-Way ANOVA）多重比較（LSD）及雙變量相關(guān)分析，P<0.05為有顯著

13、性差異的標準。 初步結(jié)論： 1.CNSL組患者腦脊液中白細胞數(shù)量、蛋白含量明顯比對照組高；提示了腦脊液中白細胞數(shù)量和蛋白含量的改變對中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病的診斷有意義；兩組腦脊液壓力、葡萄糖和氯結(jié)果比較無差異。說明了腦脊液壓力、葡萄糖和氯對于中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病的診斷可能非特異。 2.CNSL組患者腦脊液的SOD活性明顯高于對照組患者，且CNSL組患者腦脊液中白細胞數(shù)量和蛋白含量分別與SOD活性呈正相關(guān)關(guān)系，提示了氧化

14、損傷機制參與了中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病發(fā)病過程，SOD活性的測定能否用于檢測疾病的進展，觀察療效，判斷預(yù)后還有待進一步研究。 3.不同年齡組中以45-59歲年齡組腦脊液SOD活性最高，<45歲年齡組SOD活力最低，<45歲年齡組與另兩個高年齡組腦脊液SOD活性比較有顯著性差異，45-59歲年齡組與>60歲組腦脊液SOD活性比較無差異，提示了腦脊液SOD活性的變化可能與年齡有關(guān)。 4.不同濃度（4×10-5 mol/L、2×10

15、-4mol/L、1×10-3 mol/L）的青蒿琥酯處理K562細胞48小時，細胞總凋亡率呈濃度依賴性，青蒿琥酯作用濃度越高，K562細胞凋亡率越高。隨著凋亡率的增加，K562細胞SOD活性以及MnSOD、SeGPx mRNA表達也隨著變化。各濃度組中以4×10-5mol/L組K562細胞SOD活性以及MnSOD、SeGPx mRNA表達最高。隨著青蒿琥酯作用濃度的繼續(xù)增加，凋亡率隨之升高，但K562細胞SOD活性以及MnSOD、SeG