基質(zhì)金屬蛋白酶（MT1-MMP-MMP-2）及其組織抑制劑（TIMP-2）在人乳腺癌組織中表達的研究.pdf

1、目的:乳腺癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率有逐年上升趨勢，研究和探討乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移機制成為目前研究的熱點。眾多研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移是一個多步驟的復(fù)雜過程，其中腫瘤周圍基底膜的降解是腫瘤細胞向鄰近結(jié)締組織浸潤進而向遠處轉(zhuǎn)移過程中最基本的一步，基底膜完整性的喪失與局部擴散，遠處轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后密切相關(guān)。而由腫瘤組織分泌的基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrixmetalloproteinases，MMPs)能夠引起細胞外基質(zhì)和基底膜的降解

2、，從而促進腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，同時其抑制因子可以抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的活性，從而保持基底膜的完整性，阻止腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。目前，國內(nèi)對基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制劑在乳腺癌中的表達的情況和臨床意義以及它們生物學作用研究較少。因此，本課題利用免疫組化(IHC)和蛋白印跡(WB)兩種實驗方法在蛋白水平上研究MMP-2、TIMP-2和MT1-MMP在乳腺癌中的表達特點及與乳腺癌的臨床病理因子之間相互關(guān)系，以探討三者在乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移機制中的作用，并可

3、為基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑在乳腺癌治療中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。 方法:選取2004年5月至2004年12月在中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院腫瘤外科行手術(shù)治療的64例乳腺癌患者的腫瘤組織標本(一部分以10％的福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，制成實驗標本蠟塊備用)，同時收集30例乳腺良性腫瘤組織標本，所有標本均于離體半小時內(nèi)采集，液氮速凍，后轉(zhuǎn)至-80℃冰箱貯存待用，所有標本均經(jīng)病理證實，首先應(yīng)用免疫組化(Immunohistochemistry，

4、IHC)的實驗方法，檢測事先制備好的64例乳腺癌組織標本中MMP-2、TIMP-2和MT1-MMP的表達情況，對于34例共同陽性表達的標本應(yīng)用免疫組化圖像分析軟件進行計量分析，然后采用蛋白印跡(WesternBlot)的實驗方法分別檢測30例乳腺癌組織和30例乳腺良性腫瘤組織中MMP-2、TIMP-2和MT1-MMP的表達情況，結(jié)果分析以電泳條帶上各產(chǎn)物的面積與灰度值的乘積作為積分光密度值，作為乳腺癌中各產(chǎn)物的表達水平的參數(shù)。應(yīng)用SAS

5、6.12(StatisticalAnalysisSystemVersion6.12)統(tǒng)計分析軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。首先根據(jù)實驗?zāi)康暮蛯嶒灁?shù)據(jù)類型，明確統(tǒng)計分析方法，采用基礎(chǔ)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計描述(StatisticsDelineation)，正態(tài)性檢驗(TestofNormality)，數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換(DataTransformation)，T檢驗(Ttest)和單因素方差分析(AnalysisofVariance)等統(tǒng)計分析方法，編寫SAS代

6、碼，完成統(tǒng)計分析的自動化，顯著檢驗水準α值取0.05。 結(jié)果:應(yīng)用免疫組組織化學的實驗方法檢測到MMP-2，TIMP-9和MT1-MMP在64例乳腺癌組織中共同陽性表達的為34例，圖形分析系統(tǒng)分析分別得出具體表達值分別為：3.11±0.74，2.86±0.65，3.06±0.88(數(shù)據(jù)經(jīng)過自然對數(shù)轉(zhuǎn)換)。陽性表達主要定位于癌細胞質(zhì)內(nèi)，呈棕色顆粒狀彌散分布，細胞核陰性，間質(zhì)細胞表達少。乳腺癌組織中MT1-MMP，MMP-2和TIM

7、P-2的表達以乳腺癌臨床病理因子(T分期，N分期，TNM分期，ER，PR和C-erbB-2)分組分層后分析各組各層間是否存在差異，本實驗回答是否定的，即各組間無明顯差異，無統(tǒng)計學意義。應(yīng)用蛋白印跡的實驗方法檢測到MT1-MMP，MMP-2和TIMP-2蛋白在30例乳腺癌及良性乳腺腫瘤組織中均有表達，在乳腺癌組織及良性乳腺腫瘤組織中MT1-MMP蛋白的表達水平分別為90.50±27.71，23.70±9.35(t=-12.51，P＜0.0

8、01)；MMP-2蛋白的表達水平分別為140.23±+46.82，47.30±16.03(t=-9.35，P＜0.001)；TIMP-2蛋白的表達水平分別為67.57±37.10，10.40±7.44(t=-9.30，P＜0.001)，MT1-MMP，MMP-2和TIMP-2分別在乳腺良惡性腫瘤組織中的表達存在著極顯著的差異。本研究也試圖探討在乳腺癌組織中，MT1-MMP，MMP-2和TIMP-2三者之間蛋白表達的相關(guān)性，但由于樣本量較

9、小，不支持相關(guān)性分析，所以未能得出三者之間的相關(guān)性結(jié)論。本研究又通過采用蛋白印跡(WesternBlot)的方法，來觀察乳腺癌組織中MT1-MMP，MMP-2和TIMP-2的表達以乳腺癌臨床病理因子(T分期，N分期，TNM分期，ER，PR和C-cerbB-2)分組分層后分析各組各層間是否存在差異，本實驗回答是否定的，即各組各層間無顯著性差異。但是，經(jīng)過數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換后采用各組間T檢驗進行統(tǒng)計分析，在TNM分期Ⅱ、Ⅲ期之間MMP-2蛋白表達分別

10、為：160.38±47.16，124.80±27.93(t=2.25，P=0.0356)；TIMP-2蛋白表達分別為：53.38±17.02，80.40±38.49(t=-2.27，P=0.0338)，即MMP-2和TIMP-2蛋白表達分別在TNM分期Ⅱ、Ⅲ期之間存在著顯著的統(tǒng)計學差異，由此可見這是本實驗蛋白印跡方法所得到的又一個發(fā)現(xiàn)。 結(jié)論:綜上所述，本研究通過蛋白印跡實驗方法提示乳腺癌中MT1-MMP，MMP-2和TIMP-

11、2蛋白的表達與良性乳腺腫瘤組織的表達存在顯著差異。那么MT1-MMP，MMP-2和TIMP-2蛋白的的聯(lián)合檢測可以提示乳腺癌的發(fā)病情況。在TNM分期Ⅱ，Ⅲ期之間MMP-2以及TIMP-2存在著顯著的統(tǒng)計學差異，即MMP-2和TIMP-2對于Ⅱ，Ⅲ期乳腺癌患者的腫瘤惡性行為以及在預(yù)后和治療方面都有提示和指導作用，反應(yīng)腫瘤有更高的惡性生物學行為以及可能成為乳腺癌不良預(yù)后的一個指標。本研究還通過免疫組化實驗觀察到MT1-MMP，MMP-2和T