縫隙連接在腦血管痙攣病理機(jī)制中作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　研究自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下腔出血（SAH）后不同時(shí)間段大鼠基底動(dòng)脈縫隙連接通道(GJ)變化與腦血管痙攣(CVS)的關(guān)系,即觀察基底動(dòng)脈（BAs）在SAH后不同時(shí)間段基底動(dòng)脈縫隙連接通道電生理變化及檢測(cè)縫隙連接蛋白（conexins Cxs）表達(dá)變化與CVS的關(guān)系，且給予縫隙連接阻斷劑18β-甘草次酸對(duì)該通道的調(diào)節(jié)作用,為更深入研究SAH后CVS的發(fā)生機(jī)制奠定理論依據(jù)，為今后臨床病人SAH后CVS的預(yù)防及治療提供新的藥物靶點(diǎn)和途

2、徑。
　　方法：
　　實(shí)驗(yàn)分組：Sprague Dawley大鼠共120只,隨機(jī)數(shù)字表法分4組：對(duì)照組（n=30）、假手術(shù)組（n=30）、手術(shù)組（n=30）、治療組（n=30），每組隨機(jī)數(shù)字表法分成5亞組（n=6），即第1d、3d、5d、7d、14d。
　　模型建立及藥物處理：同種型雄性Sprague Dawley大鼠采用視交叉前池二次注血法建立SAH模型，治療組二次注血后第1d腹腔注射縫隙連接阻斷劑18β-甘草次酸（

3、10mg/kg）進(jìn)行干預(yù)，以后每日一次，直至各時(shí)間段處死。
　　神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分：參考Kaoutzanis M等的神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分法，從運(yùn)動(dòng)反應(yīng)、睜眼反應(yīng)及飲食三方面分別對(duì)各組模型鼠術(shù)后第1d、3d、5d、7d、14d對(duì)模型大鼠進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分，評(píng)分范圍3至11分，3分最差，11分正常。
　　模型鑒定：各組模型鼠麻醉后，取腦于10％福爾馬林溶液中固定24h行HE染色。光鏡下觀察蛛網(wǎng)膜下腔出血及血管形態(tài)學(xué)變化。
　　腦血管

4、直徑測(cè)量：各組模型鼠麻醉后，斷頭取腦將剝?nèi)?-3mm基底動(dòng)脈移入灌流槽內(nèi)固定。用Myoview軟件控制血管內(nèi)壓力穩(wěn)定在60mmHg、溫度37℃，測(cè)基底動(dòng)脈外徑。
　　腦血管Cxs表達(dá)檢測(cè)：各組模型鼠麻醉后，斷頭取腦于0.9%生理鹽水中，解剖顯微鏡下剝?nèi)ツX血管液氮速凍，提取總蛋白，western blotting技術(shù)檢測(cè)Cx37、Cx40、Cx43、Cx45。
　　觀察GJ電導(dǎo)率變化：不同時(shí)間段麻醉模型鼠，剝?nèi)ブ睆?0-80u

5、m，長(zhǎng)0.4mm腦血管，進(jìn)行消化處理后，使用AXON700B放大器在電壓膜片鉗下記錄一段腦微血管縫隙連接通道電生理變化。
　　結(jié)果：
　　建立SAH模型及鑒定：SAH后通過(guò)HE染色后光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)蛛網(wǎng)膜下腔可見(jiàn)大量陳舊性積血，SAH后基底動(dòng)脈明顯痙攣，形態(tài)學(xué)發(fā)生明顯變化，給予18β-甘草次酸后明顯緩解。
　　神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分變化：SAH后大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分第3d開(kāi)始下降，至第7d降至最低，第14d出現(xiàn)恢復(fù)，給予18β-甘

6、草次酸后明顯改善。
　　基底動(dòng)脈直徑測(cè)量：SAH后基底動(dòng)脈外徑第1d開(kāi)始縮窄，至第7d達(dá)最小，第14d開(kāi)始恢復(fù)變粗，給予18β-甘草次酸后明顯變粗。
　　腦血管縫隙連接蛋白表達(dá)：
　　1）Cx37蛋白未檢測(cè)到。
　　2）Cx40蛋白表達(dá)檢測(cè)：SAH后第3dCx40蛋白表達(dá)濃度開(kāi)始下降，至第7d達(dá)最低值，第14d開(kāi)始恢復(fù)升高，治療組未見(jiàn)顯著變化。
　　3）Cx43、Cx45蛋白表達(dá)檢測(cè)：SAH后第1dCx43

7、蛋白表達(dá)濃度開(kāi)始升高，至第7d達(dá)最高值，第14d開(kāi)始降低，治療組未見(jiàn)顯著變化。
　　縫隙連接通道電導(dǎo)率變化：SAH后第1d縫隙連接通道電導(dǎo)率開(kāi)始升高，至第7d達(dá)最高值，第14d開(kāi)始降低，治療組未見(jiàn)顯著變化。
　　結(jié)論：
　　視交叉前池二次注血法可以成功建立蛛網(wǎng)膜下腔出血模型。
　　SAH后CVS的發(fā)生與腦血管GJ形態(tài)結(jié)構(gòu)及電生理變化相關(guān)。
　　18β-甘草次酸可緩解SAH后CVS的發(fā)生，其機(jī)制可能與腦血管G