猴-鼠嵌合體動物模型的建立及表皮干細胞可塑性的研究.pdf

1、目的: 為研究靈長類表皮干細胞是否具有可塑性，建立猴-鼠嵌合體動物模型來觀察恒河猴表皮干細胞的在嵌合體中存活、分布，建立囊胚注射后體外培養(yǎng)系統(tǒng)來觀察人表皮干細胞在注射早期囊胚中的細胞遷移和基因表達的改變. 方法: 1.表皮干細胞的體外培養(yǎng)、純化和鑒定分別采用消化法培養(yǎng)恒河猴、人的表皮干細胞，用IV膠原吸附法純化表皮干細胞，純化后的細胞采用細胞免疫熒光組織雙標、逆轉錄多聚酶鏈反應(RT-PCR)、流式細胞儀細胞周期

2、檢測等方法對細胞進行鑒定。 2.囊胚顯微注射法獲得嵌合體胚胎和動物再次用顯微注射針分選表皮干細胞，用CFSE標記人表皮干細胞后進行囊胚顯微注射，注射后囊胚在體外進行培養(yǎng)；恒河猴表皮干細胞直接進行囊胚注射，注射后囊胚進行子宮移植，獲得嵌合體胚胎和動物。 3.注射后囊胚體外培養(yǎng)和細胞遷移、基因表達改變的觀察分別在注射后2、4、12、16、24小時將體外培養(yǎng)的囊胚收集，顯微鏡下進行囊胚形態(tài)觀察、共聚焦顯微鏡囊胚細胞計數(shù)、表皮干

3、細胞遷移觀察以及利用實時定量PCR檢測表皮干細胞Oct4、Nanog、K15、Integrinβ1基因表達的改變。 4.嵌合體胚胎和動物的檢測對出生后的嵌合體動物進行表型觀察，用PCR方法檢測雄性恒河猴Y染色體的標志基因SRY來觀察是否有恒河猴來源細胞的嵌合，用熒光原位雜交(FISH)方法來檢測恒河猴來源細胞在組織中的嵌合和分布。 結果: 1.體外培養(yǎng)的表皮干細胞經IV膠原分選后，表達表皮干細胞標志蛋白K14、K

4、19和外胚層前體細胞標志蛋白Nestin，細胞周期檢測表現(xiàn)為慢細胞周期，G0/G1期細胞占80％以上，RT-PCR結果顯示分選后細胞表達K15、Integrinβ1而不表達胚胎干細胞的標志基因Oct4、Nanog。 2.通過囊胚顯微注射，進行了360鼠·次的胚胎移植，成功獲得了猴鼠嵌合體成型胚胎8只和存活嵌合體動物3只，獲得體外培養(yǎng)的注射后囊胚263個。 3.注射后囊胚在培養(yǎng)4h后，開始恢復囊胚腔，12h開始孵化，24h

5、注射組的胚胎具有較高的孵化效率，但是和對照未注射組比較，內細胞團和總細胞數(shù)沒有顯著差異。注射的表皮干細胞在4h時大部分細胞遷出囊胚，少數(shù)滯留在囊胚里，16h時細胞數(shù)增多，可在滋養(yǎng)層和內細胞團檢測到標記的細胞，人表皮干細胞K15和Integrinβ1的基因分別在培養(yǎng)12h、4h后檢測不到，而直到24h也未能檢測到Oct4、Nanog基因的表達4.嵌合體存活小鼠在出生后發(fā)育、哺乳、和體型上與正常小鼠沒有什么差別，在成年后，體型較正常的小鼠稍

6、大；PCR檢測結果顯示，分別在成型胚胎中和存活的小鼠中觀察到恒河猴表皮干細胞的嵌合現(xiàn)象，在死胎的器官中通過更靈敏的巢式PCR也可檢測到陽性信號；FISH檢測結果發(fā)現(xiàn)在嵌合體胚胎的肝臟組織切片中可以發(fā)現(xiàn)有恒河猴表皮來源細胞的嵌合現(xiàn)象。 結論: 1.IV膠原分選角質細胞符合表皮干細胞的特性2.注射異源性成體干細胞后，小鼠囊胚能夠存活并正常發(fā)育3.靈長類表皮干細胞可以在小鼠囊胚中存活，并能整合到滋養(yǎng)層和內細胞團4.注射后培養(yǎng)早