DHBV衣殼蛋白表達純化、初步應用及其編碼基因轉(zhuǎn)錄、表達時相的研究.pdf

1、1.DHBV PreC/C基因序列分析、克隆表達、蛋白純化及多抗制備
　　為了建立DHBV快捷準確的檢測方法及深入探究鴨乙型肝炎病毒衣殼蛋白的功能，對DHBV CHv株PreC/C基因及其編碼蛋白的分子特性進行了分析。PCR方法擴增編碼衣殼蛋白的PreC/C基因，經(jīng)測序鑒定后構建PreC/C基因的原核表達載體pET-32a(+)/PreC/C。利用大腸桿菌宿主表達菌Rosetta(DE3)對衣殼蛋白進行誘導表達，同時對誘導溫度、誘

2、導時間、IPTG濃度進行了優(yōu)化。利用重組衣殼蛋白的組氨酸標簽，采用Ni離子親和層析柱對衣殼蛋白進行純化。通過純化的衣殼蛋白免疫大白兔制備兔抗DHBV衣殼蛋白多克隆抗體。結果表明，PreC/C基因長789 bp，編碼262個氨基酸的衣殼蛋白。構建有PreC/C基因原核表達載體pET-32a(+)/PreC/C在表達菌Rosetta(DE3)中誘導表達時，DHBV衣殼蛋白在誘導溫度37℃、IPTG濃度0.8mM、誘導時間6h的條件下其表達量

3、達到最高，占菌體總蛋白量的80％以上。利用Ni離子親和層析柱對帶有組氨酸標簽的目的蛋白進行純化后得到條帶單一、濃度達2mg/mL的重組衣殼蛋白。通過純化的衣殼蛋白免疫動物所得到的血清在瓊擴試驗中效價達到1∶32。
　　2.鴨乙型肝炎病毒衣殼蛋白間接ELISA方法的建立
　　為了建立穩(wěn)定可靠的DHBV血清學診斷方法，本研究利用重組表達的DHBV衣殼蛋白建立間接ELISA診斷方法。利用棋盤滴定法對抗原最佳包被量進行了優(yōu)化，隨后對

4、抗原的包被時間、包被溫度進行了優(yōu)化，同時對間接ELISA方法中的封閉時間、二抗工作濃度等條件進行了優(yōu)化。利用建立的ELISA方法對27份DHBV陰性血清進行檢測，確定了判定樣品為陰性或陽性的臨界值，并通過該臨界值對建立的ELISA方法敏感性、特異性、重復性及可靠性等進行了評估。結果表明，基于重組表達衣殼蛋白間接ELISA方法的最佳反應條件為:抗原37℃包被2h后4℃過夜，6.7μg/孔;1％BSA37℃封閉2h;二抗工作濃度為1∶100

5、0;待檢血清稀釋至1∶160。根據(jù)確定的臨界值0.392，DHBV陽性血清能被檢測為陽性的最大稀釋倍數(shù)為1∶12800;重復性試驗表明組內(nèi)、組間試驗的變異系數(shù)均小于10％;該ELISA方法檢測常見鴨源病原抗血清時均無陽性結果;對75份臨床樣品進行檢測時，與傳統(tǒng)的檢測方法PCR相比達到95.45％的符合率。說明該DHBV衣殼蛋白間接ELISA檢測方法具有靈敏度高、重復性好、特異性強的特點。此外，本方法運用羊抗鴨IgG抗體替代了兔抗鴨與羊抗

6、兔抗體的聯(lián)用，是該方法更為簡便快捷、節(jié)約成本。
　　3.PreC/C基因轉(zhuǎn)錄時相及表達時相的研究
　　DHBV基因組在復制的過程中會先轉(zhuǎn)錄形成一條長鏈RNA（preRNA），然后反轉(zhuǎn)錄形成DNA達到病毒基因組復制的目的。該長鏈RNA除了扮演DHBV基因組復制中間體的角色外，還能作為DHBV DNA多聚酶P蛋白的mRNA翻譯為P蛋白，或充當DHBV PreC/C基因的mRNA，翻譯為DHBV的衣殼蛋白。本研究通過建立的DHBV

7、感染鴨原代細胞模型，采用實時熒光定量PCR技術及相對定量分析方法，對preRNA在病毒感染細胞后的不同時間點進行定量分析。在相同時間點，運用間接免疫熒光及免疫印跡技術對DHBV衣殼蛋白的表達情況進行檢測。結果表明，preRNA在病毒感染后的12h開始出現(xiàn)，20h達到最大峰值;而衣殼蛋白在病毒感染后的12h及20h并未被檢測到，直到24h才能被檢測到。說明preRNA在DHBV在體外感染細胞的早期并不用于衣殼蛋白的翻譯，該結論為DHBV病