ELMOSs蛋白在乳腺癌趨化運(yùn)動(dòng)及轉(zhuǎn)移中的機(jī)制研究.pdf

1、背景和目的:
　　 乳腺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，在我國居女性惡性腫瘤的第一位，嚴(yán)重威脅著人們的生命健康。近些年來，由于對(duì)乳腺癌的早期發(fā)現(xiàn)，以及綜合治療手段的不斷提高，其死亡率呈逐年下降趨勢。然而伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)患者的預(yù)后仍然很差。腫瘤轉(zhuǎn)移由于治療效果差，已經(jīng)成為致患者死亡的主要原因。
　　 我們的研究試圖通過對(duì)乳腺癌細(xì)胞的趨化運(yùn)動(dòng)機(jī)制的探索來了解ELMO是如何調(diào)控乳腺癌細(xì)胞的遷移。趨化因子CXCL12及其G-蛋

2、白偶聯(lián)受體CXCR4能夠介導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的遷移，侵襲和轉(zhuǎn)移。但是，目前趨化因子和G蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)通路對(duì)于肌動(dòng)蛋白聚合和腫瘤細(xì)胞趨化運(yùn)動(dòng)的通路尚不明確。尤其是趨化因子-G蛋白偶聯(lián)受體-Rac的激活-肌動(dòng)蛋白聚合/ELMO蛋白，在腫瘤趨化運(yùn)動(dòng)和轉(zhuǎn)移中是以何種機(jī)制來發(fā)揮作用的將是我們的研究重點(diǎn)。從而更進(jìn)一步深入了解乳腺癌細(xì)胞的趨化運(yùn)動(dòng)和轉(zhuǎn)移機(jī)制，為乳腺癌的診斷和治療提供可靠的分子基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 1)應(yīng)用Wester

3、n Blot的方法檢測不同乳腺細(xì)胞中的ELMOs蛋白表達(dá)水平。
　　 2)應(yīng)用Wound healing Assay、Chemotaxis Assay、Invasion Assay、F-actinPolymerization Assay檢測ELMO1蛋白降表達(dá)后，對(duì)于乳腺癌細(xì)胞遷移和趨化運(yùn)動(dòng)的影響。
　　 3)應(yīng)用MTT方法檢測ELMO1是否對(duì)于乳腺癌細(xì)胞增殖有影響。
　　 4)應(yīng)用質(zhì)譜學(xué)分析方法，以求找到與EL

4、MO1相互作用的重要蛋白，并應(yīng)用Co-IP的實(shí)驗(yàn)技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證。
　　 5)利用免疫熒光共聚焦的實(shí)驗(yàn)技術(shù)和細(xì)胞成分分離的方法檢測ELMO1在細(xì)胞中的定位以及與Gai2共定位的現(xiàn)象。
　　 6)建立ELMO1降表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞系，腫瘤原位接種到小鼠脂肪墊上，構(gòu)建肺轉(zhuǎn)移模型，探討ELMO1降表達(dá)在小鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)移的影響。
　　 7)免疫組化方法檢測ELMO1在人乳腺癌組織和正常乳腺組織中的表達(dá)，分析ELMO1的表達(dá)水平與腫瘤

5、轉(zhuǎn)移等臨床病理參數(shù)的相關(guān)性。
　　 結(jié)果:
　　 1)ELMO1可以促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞遷移、趨化運(yùn)動(dòng)和侵襲的能力。
　　 我們首先觀察了ELMOs蛋白在MDA-MB-231，BT549，ZR-75-30，MCF-7，T47D，BCAP-37，SKBR3，MCF10A和HBL100的9種人乳腺細(xì)胞表達(dá)水平，ELMO1和ELMO2均有不同程度的表達(dá)。并且在較高轉(zhuǎn)移性的乳腺癌細(xì)胞諸如MDA-MB-231和BT549中高表達(dá)

6、。
　　 為了研究ELMOs蛋白對(duì)人乳腺癌細(xì)胞的遷移能力影響，我們在人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和其他兩個(gè)乳腺癌細(xì)胞株T47D和MCF-7采用基因沉默技術(shù)抑制ELMO1的表達(dá)，然后運(yùn)用體外transwell實(shí)驗(yàn)技術(shù)檢測。我們發(fā)現(xiàn)，趨化因子CXCL12對(duì)MDA-MB-231，T47D和MCF-7細(xì)胞有明顯誘導(dǎo)的趨化作用，而基因沉默ELMO1則抑制CXCL12誘導(dǎo)的趨化作用。另外檢測表明基因沉默ELMO1的細(xì)胞株表現(xiàn)為遷移能力降

7、低。為了檢測CXCL12介導(dǎo)的MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲能力，我們使用了體外基質(zhì)膠侵襲實(shí)驗(yàn)技術(shù)。MDA-MB-231細(xì)胞（正常和對(duì)照組）表現(xiàn)出明顯的侵襲能力，而siELMO1細(xì)胞株則侵襲功能受到抑制。百日咳毒素(PTX)是Gai信號(hào)通路的特異性抑制劑，使用百日咳毒素(PTX)處理細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)CXCL12所介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞的趨化作用和遷移能力進(jìn)一步受到抑制。在siELMO1沉默表達(dá)的細(xì)胞中肌動(dòng)蛋白的聚合水平則是下調(diào)的，這種下調(diào)作用在PTX

8、作用下更為明顯。我們還利用了MTT的檢測方法研究ELMO1對(duì)乳腺癌細(xì)胞的增殖作用，結(jié)果表明siELMO1細(xì)胞沒有表現(xiàn)出對(duì)細(xì)胞增殖明顯的抑制作用。
　　 2)通過質(zhì)譜分析鑒定出與ELMO1相互作用的蛋白質(zhì)。同時(shí)，ELMO1的N末端與Gai2亞基相互結(jié)合。CXCL12的刺激可以促進(jìn)Gai2與ELMO1蛋白N末端的結(jié)合，并且Gai2-ELMO1/DOCK180途徑在趨化因子受體所介導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞遷移、趨化運(yùn)動(dòng)和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。

9、r>　　 3)CXCL12誘導(dǎo)ELMO1跨膜移位。
　　 趨化因子刺激前，Gai2比ELMO1更加明顯定位在細(xì)胞膜上，在CXCL12刺激的情況下，ELMO1顯著地轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜上并與Gai2共定位（相互結(jié)合）。相反，在Gai2基因沉默的細(xì)胞中無論是否受到CXCL12的刺激，ELMO1轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜的能力被抑制。上述結(jié)果表明，CXCR4趨化受體的激活可以誘導(dǎo)依賴于Gai2的ELMO1蛋白跨膜運(yùn)動(dòng)。
　　 4)CXCL12誘導(dǎo)

10、Rac的激活和跨膜。CXCL12所誘導(dǎo)的Rac1和Rac2的激活作用可以通過阻斷Gai通路（PTX處理細(xì)胞）或者ELMO1基因沉默而被抑制。趨化因子CXCL12可以激活Gai通路并引發(fā)ELMO1/DOCK180復(fù)合體激活Rac1和Rac2。
　　 5) ELMO1對(duì)于PDK1/AKT和ERK1/2的激活是非必須的。
　　 利用生化檢測方法我們發(fā)現(xiàn)CXCL12誘導(dǎo)的PDK1和AKT的膜轉(zhuǎn)運(yùn)在siELMO1細(xì)胞和對(duì)照組乳腺癌

11、細(xì)胞中都有發(fā)生。另外，在siELMO1和對(duì)照組細(xì)胞中，PDK1和AKT的磷酸化水平并無明顯變化，而且在CXCL12誘導(dǎo)下，ERK1/2的激活也未觀察到明顯的改變。因此，無論是PDK1/AKT還是ERK1/2的激活通路，均不依賴于ELMO1。
　　 6) ELMO2在乳腺癌趨化運(yùn)動(dòng)中也發(fā)揮著相似的功能，調(diào)控乳腺癌細(xì)胞的趨化運(yùn)動(dòng)。ELMO2-YFP也可以免疫共沉淀DOCK180，Gai2, Rac1和Rac2。CXCL12的誘導(dǎo)可以

12、激活Rac1和Rac2，但在PTX處理抑制了Gai通路或者siELMO2細(xì)胞中則不能激活Rac1和Rac2，同時(shí)CXCL12誘導(dǎo)的肌動(dòng)蛋白聚合能力和趨化運(yùn)動(dòng)在siELMO2細(xì)胞中受到抑制。研究結(jié)果表明，ELMO1和ELMO2在CXCL12誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231趨化運(yùn)動(dòng)中發(fā)揮著相似的功能。
　　 7)在活體內(nèi)，ELMO1對(duì)于乳腺癌的轉(zhuǎn)移同樣起著重要的作用。我們首先檢測了ELMO1和ELMO2乳腺組織中的表達(dá)情況。EL

13、MO1/ELMO2在乳腺癌的組織中高表達(dá)。此外，ELMO1的表達(dá)水平還與乳腺癌的轉(zhuǎn)移息息相關(guān)。
　　 我們還在SCID小鼠體內(nèi)檢測了ELMO1與乳腺癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系，建立了乳腺癌肺轉(zhuǎn)移模型。研究結(jié)果表明ELMO1盡管在腫瘤生長過程中是非必要的，但是其在腫瘤體內(nèi)轉(zhuǎn)移的過程中起著重要的作用。
　　 結(jié)論:
　　 1)ELMO1可以促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞遷移、趨化運(yùn)動(dòng)和侵襲的能力。
　　 2)通過質(zhì)譜分析鑒定出與ELMO1