基于毛細管電色譜技術的藥物復雜體系分離分析方法研究.pdf

1、復雜藥物體系分析包括了植物藥有效成分的分析和生物樣品中的藥物及代謝產物的分析等。其主要特點有：（1）成分或基質復雜。一種植物藥可能就含有上百種化學成分；而在生物樣品中，許多內源性物質的存在往往很容易干擾到樣品的準確定量分析。（2）生物樣品的分析中，多數情況下是微量甚至痕量的。因此，發(fā)展高效、高選擇性、高靈敏度的分析方法成為分析工作中的重要研究內容。
　　 毛細管電色譜是一種在毛細管電泳技術的不斷發(fā)展和高效液相色譜技術與理論日益完

2、善的基礎上逐步興起的以電遷移原理和色譜分離原理相結合的新型分離分析技術，它結合了毛細管電泳的高效性和毛細管液相色譜的高選擇性，是目前微分離分析領域的研究熱點之一。
　　 毛細管電色譜的分離結合電泳作用力和色譜分配作用兩種分離機制，通過溶質在流動相和固定相之間的分配系數的不同和自身電泳淌度的差異實現，具有快速、靈敏、樣品和溶劑消耗少等優(yōu)點。
　　 根據分離過程中驅動力的不同可以將毛細管電色譜分為電滲流驅動型和壓力電滲流雙重

3、驅動型電色譜兩種技術。電滲流驅動型毛細管電色譜以電滲流為驅動力，使樣品區(qū)帶保持平塞型流型，因此柱效好，靈敏度高；壓力驅動型電色譜即加壓毛細管電色譜，在使用電滲流的同時使用壓力作為驅動力，這樣可以加快分析速度，便于梯度洗脫，減小在使用填充柱時由于柱塞引起的氣泡問題。
　　 毛細管電色譜柱在毛細管電色譜分離體系中占據最重要的地位，它具有雙重作用：一是作為固定相，承擔對對象的分離任務；二是在其表面形成雙電層，在電場作用下產生EOF作為

4、驅動力。根據固定相的材質以及制備方法的不同，毛細管電色譜柱分為毛細管開管柱、毛細管填充柱和毛細管整體柱。
　　 毛細管開管柱主要通過涂布、鍵合和溶膠一凝膠等方法在柱內壁制備薄層固相，使溶質在依靠電泳淌度的差異進行分離的基礎上，輔以一定的色譜分離機理，所以制備關鍵是如何通過增大表面積來增大柱容量。開管柱的優(yōu)點是柱效高，但相對于填充柱和整體柱，其相比低、柱容量小且重現性較差。
　　 將色譜用顆粒固定相裝填入毛細空管而成的毛細

5、管填充柱，目前技術最為成熟且已經商品化，可以說是高效液相色譜柱的一種微型化應用。這種柱技術繼承了傳統(tǒng)液相色譜柱選擇性好的優(yōu)點，又解決了開管柱相比低、柱容量小、重現性較差的問題。但是由于柱填充和柱塞的制備工藝對操作者要求比較高，且柱塞的存在增大了氣泡產生的風險和柱折斷的概率；另外，由于使用鍵合硅膠作為固定相，使流動相的pH范圍只能選擇在2～8之間，這些缺點使毛細管填充柱的應用受到了一定的限制。
　　 與毛細管填充柱不同的是，毛細管

6、整體柱由聚合液在毛細管內原位聚合而成，無須制備柱塞，柱長也可方便地加以控制，可根據基體及表面官能團的需要選用不同的有機單體進行聚合反應，也可通過對參加反應的單體或不參與反應的致孔劑比率加以調控而靈活地控制聚合物的孔隙率等參數。具有制備方法簡單，內部結構均勻，通透性、重現性好，柱效高，固定相表面易于改性，無需制備柱塞和可進行快速分離等優(yōu)點，近幾年發(fā)展迅速，被廣泛地應用于各種酸性、堿性及中性小分子、核酸、氨基酸、多肽及蛋白質大分子生物樣品、

7、食品樣品及環(huán)境樣本等復雜微量體系的分離分析。根據所制備的整體材料的不同，整體柱分為有機聚合物整體柱、無機聚合物整體柱和顆粒固定化整體柱。其中有機聚合物整體柱的制備方法是將單體混合物（功能單體、交聯劑以及電滲流產生劑）、致孔劑混合物（通常為二元或三元致孔劑）和引發(fā)劑的混合溶液加入空管柱中通過熱引發(fā)或光引發(fā)聚合。反應完全后用有機溶劑和水除去致孔劑及其它未反應化合物即可。但是毛細管整體柱也存在一些問題：這種柱制備技術是近二十年才逐漸發(fā)展起來的

8、新興柱技術，因此在很多方面還只是處于研究探索階段，就本課題所研究的甲基丙烯酸酯類整體柱而言，目前制備技術較為成熟的為引入短鏈功能單體的甲基丙烯酸丁酯整體柱，這種整體柱中的功能基團為四個碳的烷鏈，在相同條件下，選擇性勢必弱于以ODS為填充固定相的毛細管填充柱。若沒有合理的控制各聚合液成分的配比的情況下引入長鏈功能單體，柱效反而不如短烷鏈的整體柱。
　　 綜上所述，毛細管填充柱以及毛細管整體柱也各有其優(yōu)缺點，不同驅動模式的毛細管電色

9、譜具有不同的特點和使用范圍。
　　 本課題對這兩種毛細管柱在上述提及的兩種不同毛細管電色譜技術上的應用進行了考察，對其適用性進行探討和研究。研究表明pCEC是一種以壓力為主要驅動力，EOF為次要驅動力的電色譜技術，或可稱之為電壓輔助的微徑液相技術，某種意義上來說，類似于傳統(tǒng)液相柱的毛細管填充柱由于優(yōu)越的選擇性與其更為匹配；另一方面，主要使用壓力作為主要驅動力的pCEC又可以有效地抑制毛細管填充柱易產生氣泡的問題，同時，采用梯度洗

10、脫的手段可以更加快速有效的進行復雜樣品的分離。綜上我們認為使用毛細管填充柱的pCEC技術在分離分析復雜樣品上，具有優(yōu)越表現，如中藥指紋圖譜的建立。毛細管整體柱由于沒有柱塞，避免了填充柱中相不均勻性造成的氣泡問題，更為適用于基本上只有EOF作為驅動力的常規(guī)CEC技術，且毛細管整體柱通透性更好，所以可以實現柱效更高的快速分離分析，如中藥主要有效成分的質量控制以及生物體內樣品的分析。
　　 具體研究工作包括：
　　 1.南北五

11、味子所含木脂素的種類及其含量的差別較大，但市場流通中二者混用現象較為普遍，因此利用pCEC等度技術和自制毛細管填充柱，以五味子中七種木脂素作為特征成分，并對其中五種進行分離分析和含量測定，達到質量控制的目的。
　　 2.針對等度洗脫復雜樣品耗時較長的問題，進一步運用pCEC梯度洗脫技術，成功分離銀杏葉提取物中多種黃酮醇苷類成分，完成其指紋譜的初步建立。在此基礎上，將商品化毛細管填充柱和自制毛細管有機聚合物整體柱同時運用于此技術，

12、對其分離機理和性能進行比較和評價。發(fā)現在pCEC模式下，以ODS為填料的毛細管填充柱在分離效果和選擇性上優(yōu)于以甲基丙烯酸丁酯作為功能單體的甲基丙烯酸酯類整體柱，說明相較于甲基丙烯酸酯類整體柱，填充柱與pCEC模式更為匹配。但是，這種技術也存在一些制約其進一步發(fā)展的不足：（1）pCEC無冷凝系統(tǒng)，無法解決焦耳熱問題，進而無法施加較高電壓，電色譜優(yōu)勢無法完全得以體現，待分析物質主要是依靠色譜機理分離，使得其應用范圍具有一定局限性；（2）毛細

13、管填充柱的制備對裝填技術要求較高，且由于毛細管柱兩端需要燒制柱塞，使得填充柱易產生氣泡，影響分離分析。毛細管整體柱采用原位聚合法，制備過程簡單方便，通透性好，同時避免了在柱兩端燒制柱塞的問題。所以尋找適宜整體柱的電色譜模式可以很大程度上拓展其應用范圍。
　　 3.商品化的電泳儀既配有冷凝系統(tǒng)，又可以在柱兩端施加較高的直流電壓，使得運用整體柱進行分離時在施加高電壓時不致產生過大的焦耳熱，且在電泳儀上進行電色譜實驗時，平塞流型的EO

14、F作為主要驅動力，使色譜峰型更為尖銳，柱效更高。因此本章首先對甲基丙烯酸酯類整體柱的單體混合物比例以及三元致孔劑的比例進行進行了單因素考察和優(yōu)化；其次，在結合快速分離和柱效優(yōu)化的基礎上選取最為合適的整體柱建立快速分離、分析蛇床子提取物中主要活性成分異虎耳草素、香柑內酯、歐前胡素以及蛇床子素的CEC方法，并將其與HPLC，pCEC進行比較，結果證明運用有機聚合物整體柱的CEC方法，在保證所有物質基線分離的基礎上，分析時間明顯縮短且柱效更高

15、。
　　 4.本章在上一章的研究基礎上，又對白芷提取物中的主要活性成分歐前胡素、珊瑚菜內酯、發(fā)卡二醇以及異歐前胡素進行分離分析和含量測定，并采用目前廣泛使用、技術較為成熟的甲基丙烯酸丁酯整體柱制備技術，在流動相中添加去氧膽酸鈉作為“動態(tài)固定相”，增加分離選擇性，成功解決了該柱因功能性基團碳鏈較短（C4）而造成的固定相選擇性不高，溶質保留不夠的缺點，成功對白芷中五種較難單純使用甲基丙烯酸丁酯整體柱分離的香豆素成分進行快速有效地分離

16、分析。
　　 5.鑒于毛細管整體柱的CEC方法具有快速有效的特點，拓展其應用范圍，對抗抑郁藥米氮平進行了臨床藥代動力學研究。首先考察了不同電滲流產生劑對電滲流方向、樣品峰型及靈敏度的影響，最終選擇無電滲流的甲基丙烯酸酯整體柱進行實驗。接下來通過在線場放大樣品富集技術（field-amplifled sample injection，FASI）解決毛細管微分離系統(tǒng)中的濃度檢測限較低的問題，最終選擇70％7，腈作為樣品溶劑，使樣品和

17、主要代謝產物的定量下限均達到2ng/mL。最后，采用液液萃取為前處理方法，使用CEC技術對人血漿樣品中的米氮平及其主要代謝產物去甲米氮進行分離，實現了常規(guī)實驗條件下快速、經濟地分離分析，并成功應用于其臨床藥代動力學研究。
　　 盡管目前為止，運用毛細管整體柱的CEC技術在分離分析方面有其獨到之處，但是增強其選擇性仍然是不懈追求的方向。本文在上述實驗的基礎上，對今后研究工作的思路和方向進行了一定的探索和展望。采用中心組合設計法對中