肝癌血清miRNA的提取,分離及檢測(cè)研究.pdf

1、近年來,隨著生物信息學(xué)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展,目前已發(fā)現(xiàn)大量的微小RNA(microRNA或miRNA),其作用遍及生命體的發(fā)生、生長(zhǎng)、發(fā)育、分化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、疾病和死亡的過程。對(duì)miRNA的研究已經(jīng)從識(shí)別miRNA、闡明其作用機(jī)制,轉(zhuǎn)移到鑒定其功能。尤其在腫瘤的研究中,miRNA成熟體或前體序列的表達(dá)異常直接影響腫瘤發(fā)生,發(fā)展及分化程度。因此,miRNA對(duì)腫瘤的研究非常重要。
　　miRNA是一類長(zhǎng)約18-24nt的非編碼調(diào)控

2、單鏈小分子RNA。在大多數(shù)情況下,miRNA通過與靶目標(biāo)的3'非編碼區(qū)的多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生不完全互補(bǔ),而在翻譯水平上負(fù)調(diào)控靶基因的表達(dá);當(dāng)miRNA與其靶目標(biāo)發(fā)生完全互補(bǔ)時(shí),也可以特異性地切割其靶基因。
　　miRNA作為真核生物體內(nèi)重要功能的重要調(diào)節(jié)因子,近年來在動(dòng)物和植物中被廣泛研究。隨著實(shí)驗(yàn)方法和生物信息學(xué)的進(jìn)展,越來越多的miRNA被克隆出來,但是在各個(gè)物種中所鑒定的miRNA的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不及其理論上的飽和值,所以對(duì)miRNA

3、的分離鑒定依然是miRNA研究的一個(gè)熱點(diǎn)方向。近來的一些研究報(bào)告表明,miRNA與癌癥發(fā)展有關(guān)。盡管腫瘤標(biāo)記物極大地促進(jìn)了臨床診斷和治療,但是,在靈敏度和特異性上與臨床應(yīng)用的要求依然有很大的差距。無創(chuàng)腫瘤標(biāo)記物的研究是目前腫瘤研究領(lǐng)域中的一個(gè)熱點(diǎn)。對(duì)血清/血漿標(biāo)記物的研究在腫瘤診斷研究中更是熱點(diǎn)中的焦點(diǎn)。最近,美國(guó)弗雷德哈欽森癌癥研究中心報(bào)道:癌細(xì)胞釋放一種有效調(diào)控基因表達(dá)并進(jìn)入血液循環(huán)的重要分子—miRNA,因此血清miRNA就成為腫

4、瘤檢測(cè)研究工作的重點(diǎn)。為了進(jìn)一步認(rèn)識(shí)血清miRNA、闡明其作用機(jī)制及其功能,為血清標(biāo)記物的研究提供科學(xué)依據(jù),分離純化并獲得血清miRNA是至關(guān)重要的。本課題的研究目的是探索分離提取和鑒定肝癌血清miRNA的方法,為建立肝癌血清miRNA的表達(dá)譜和探索肝癌血清標(biāo)記物在腫瘤無創(chuàng)診斷和治療中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.以人肝癌血清作為材料,采用4種分離提取試劑提取肝癌血清總RNA或者小分子RNA(指分子量≤200nt的R

5、NA),選擇最佳提取方法;
　　2.在miRNA3'和5'端添加接頭并采用RT-PCR擴(kuò)增的方法制備miRNA的cDNA文庫(kù);
　　3.將miRNA的cDNA文庫(kù)擴(kuò)增并與T載體連接,轉(zhuǎn)化到E.coliJM109,挑取陽(yáng)性菌落,并進(jìn)一步測(cè)序鑒定。
　　結(jié)果:
　　1.本文分別采用4種不同的提取試劑來獲取血清的miRNA,以比較各種提取試劑的優(yōu)缺點(diǎn),來選擇提取血清miRNA的最佳試劑。但結(jié)合不同試劑本身的特征及實(shí)驗(yàn)的

6、前期操作,可知,各種試劑都有其適用范圍。同位素放射自顯影檢測(cè)結(jié)果顯示其中三種試劑提取到的血清小分子RNA(指分子量≤200nt的RNA)的條帶均不太清楚。
　　2.將已知小核酸片段與3'端和5'端的接頭連接,并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coliJM109中,通過交錯(cuò)PCR法檢測(cè)及測(cè)序,結(jié)果顯示,3'端和5'端的連接子與已知小核酸片段連接成功。表明該連接方法合理可用,可將此方法應(yīng)用到肝癌血清miRNA與3'端和5'端連接子的連接中。

7、>　　3.本研究采用交錯(cuò)PCR的方法來篩選肝癌血清miRNA連接產(chǎn)物的陽(yáng)性克隆,并對(duì)其進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序結(jié)果說明陽(yáng)性克隆中均含有目的片段。同時(shí),用組合引物法確定基因片段插入方向的結(jié)果與測(cè)序結(jié)果是一致的,進(jìn)一步證明交錯(cuò)PCR法篩選和鑒定陽(yáng)性克隆的可靠性。
　　4.肝癌血清miRNA與3'端和5'端的接頭連接、克隆檢測(cè)和測(cè)序結(jié)果顯示,連接、克隆和轉(zhuǎn)化成功,插入的片段為4-5個(gè)堿基。
　　結(jié)果分析:
　　本研究中肝癌血清miRN

8、A與3'端和5'端連接子的成功連接,以及克隆轉(zhuǎn)化和鑒定的結(jié)果均表明實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)和方法的合理性,也為進(jìn)一步研究分離克隆血清miRNA提供了科學(xué)依據(jù)。然而獲得的miRNA片段的大小與我們所預(yù)期的有差異,可能原因是血清miRNA與提取試劑不配套。目前試劑公司主要開發(fā)的是針對(duì)動(dòng)植物組織中miRNA的提取,還沒有專門針對(duì)血清miRNA的提取試劑。此外,導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果與期望的結(jié)果不理想的原因還有:①成熟的miRNA是以miRNA/Ago蛋白聚合體的形