腸淋巴液致休克大鼠多器官損傷的作用及機制研究.pdf

1、失血性休克(hemorrhagicshock)是臨床常見急癥，在失血性休克的發(fā)展過程中，會引起腸道屏障功能障礙和腸內細菌/內毒素移位(bacteria/endotoxintranslocation，BET)，導致腸源性感染，進而引起肺、肝、心、腎等多個器官的功能改變，誘發(fā)多器官功能障礙綜合征(multipleorgandysfunctionsyndrome，MODS)，嚴重威脅著人類生命，常常導致病人死亡。失血性休克致器官損傷的發(fā)生機制

2、可能與休克引起失控的全身炎癥反應綜合征(systemicinflammatoryresponsesyndrome，SIRS)以及腸源性內毒素血癥等環(huán)節(jié)有關。淋巴學是循環(huán)系統(tǒng)研究的薄弱領域，長期以來，一直認為淋巴途徑是血液循環(huán)回流的輔助部分。作者多年的研究工作發(fā)現(xiàn)，淋巴微循環(huán)與休克的發(fā)生、發(fā)展及轉歸關系密切，結扎腸系膜淋巴管阻斷腸淋巴液回流，可減輕二次打擊大鼠的器官功能障礙，降低炎癥反應. 目的本研究通過整體動物實驗，觀察腸系膜淋

3、巴管結扎阻斷淋巴回流對失血性休克大鼠多器官的損傷作用，從器官形態(tài)、功能及自由基(FR)、一氧化氮(NO)、腫瘤壞死因子(TNFα)、白介素-6(IL-6)的變化，探討其發(fā)病學機制；同時建立大鼠肺微血管內皮細胞(pulmonarymicro-vascularendothelialcells，PMVEC)的原代培養(yǎng)技術，在離體條件下研究休克淋巴液對PMVEC的損傷作用，觀察休克淋巴液對PMVEC的形態(tài)、代謝活力、增殖與凋亡、凋亡相關基因及炎

4、癥介質基因表達的影響，闡明休克淋巴液對多器官損傷的細胞分子機制，進一步揭示腸淋巴液回流在休克發(fā)病學中的作用及意義。 方法1)大鼠重癥失血性休克模型的復制大鼠肌注2％的戊巴比妥鈉(50mg/kg)全身麻醉，無菌手術，行右側頸總動脈和左側頸靜脈插管，舌靜脈注射0.5％肝素(1ml/kg)，全身抗凝。 2)存活率觀察30只Wistar雄性大鼠，均分為假手術組、休克組、結扎組3組(均n=10)。休克組及結扎組按“方法1)”復制失

5、血性休克模型。輸液復蘇后行腹部手術，結扎組行腸系膜淋巴管結扎術；休克組及假手術組僅在腸系膜淋巴管下穿線，不結扎。 3)器官功能及形態(tài)學觀察18只Wistar雄性大鼠，分為假手術組、休克組、結扎組3組(均n=6)，用于器官功能及形態(tài)學觀察。按“方法1)、2)”復制失血性休克模型，3組動物分別于休克輸液復蘇后(或相當)6h，再次麻醉，頸總動脈插管，放血，制備血清。全自動血氣酸堿分析儀檢測動脈血pH、PaO2、PaCO2等反映肺功能的

6、指標； 4)組織勻漿制備及炎癥介質檢測78只大鼠分為假手術組、休克組、結扎組，用于不同時間點的組織勻漿制備及炎癥介質檢測。按“方法1)、2)”復制失血性休克模型，休克組于維持低血壓90min后、輸液復蘇后0h，休克組及結扎組于輸液復蘇后1h、3h、6h、12h、24h等時間點(各時間點n=6)，假手術組于完成假手術后，分別處死動物。 5)PMVEC的原代培養(yǎng)70～100g的Wistar雄性大鼠，戊巴比妥鈉全身麻醉后，75

7、％的酒精浸泡消毒。開胸取出肺臟，置入預冷的Hank's液中，除去殘留血液，小心將肺的邊緣組織剪成1mm3大小的組3織小塊，貼入無菌的培養(yǎng)瓶中，經培養(yǎng)箱固化2h后，加入DMEM培養(yǎng)基進行PMVEC的原代培養(yǎng)。當細胞融合后，經胰蛋白酶消化后進行傳代培養(yǎng)，應用第三代PMVEC進行本研究。 6)休克淋巴液的引流復制大鼠失血性休克模型，部分大鼠行腸系膜淋巴管插管，引流重癥休克期腸系膜淋巴液，時間為2h左右，量為0.5ml左右，離心取上清液

8、，儲存于-80℃冰箱內備用；其它大鼠行門靜脈插管，制備休克門靜脈血漿。此外，應用正常雄性大鼠同法腸系膜淋巴管插管或門靜脈插管，制備正常淋巴液及門靜脈血漿，作為對照。 7)PMVEC形態(tài)、增殖周期的觀察實驗分為6組：A組(10％胎牛血清組)：培養(yǎng)液為DMEM+10％胎牛血清；B組(正常淋巴液組)：培養(yǎng)液為DMEM+正常淋巴液；C組(休克淋巴液組)：培養(yǎng)液為DMEM+休克淋巴液；D組(正常血漿組)：培養(yǎng)液為DMEM+正常血漿；E組(

9、休克血漿組)：培養(yǎng)液為DMEM+休克血漿；F組(無血清對照組)：培養(yǎng)液為DMEM。 8)休克淋巴液對PMVEC凋亡相關基因及炎癥介質基因表達的影響4％終濃度的休克淋巴液與PMVEC孵育6h后，經胰蛋白酶消化，制備細胞懸液。用UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒，一步法提取細胞總RNA，逆轉錄出的cDNA，-20℃保存?zhèn)溆?。按AMV一步法RT-PCR試劑盒說明，優(yōu)化實驗條件，用β-actin作為內參照，分別檢測PMVE

10、C的凋亡相關基因bcl-2、bax、Fas、FasL、炎癥介質TNFα、IL-6、iNOS以及血管內皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)的mRNA表達；PCR產物經1.5％瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下拍照后進行密度掃描，計算待測基因與β-actin的灰度值比表示待測基因的相對表達量。 9)休克淋巴液中內毒素、TNFα、IL-6檢測24只Wistar雄性大鼠，按“方法1)”復制重癥失血

11、性休克模型，按“方法6)”進行休克淋巴液、休克血漿、正常淋巴液、正常血漿的引流(均n=6)，封存于無熱原玻璃管中，4-80℃冷凍保存；采用改良的偶氮基質顯色鱟試驗(LAL)定量法檢測內毒素水平。同時，另取部分引流的休克淋巴液、休克血漿、正常淋巴液、正常血漿按“方法3)”檢測TNFα、IL-6的含量。 結果1)24h存活率觀察，休克組大鼠顯著低于假手術組與結扎組(P＜0.05)。血氣分析，休克組與假手術組、結扎組及實驗前比較，動脈

12、血pH、PaO2顯著降低、PaCO2明顯升高(P＜0.01，P＜0.05)；血清生化指標檢測，休克組大鼠血清AST、ALT、BUN、Cre、LDH-1、CK-MB水平顯著高于實驗前、假手術組和結扎組(P＜0.01)。 2)結扎腸系膜淋巴管阻斷淋巴液回流可減少器官組織勻漿促炎細胞因子及介質的生成與釋放。失血性休克大鼠于輸液復蘇后不同時間點的肺、肝、心、腎勻漿的MDA、NO含量、NOS、MPO活性、TNFα、IL-6水平均顯著高于假

13、手術組，且SOD活性顯著低于假手術組(P＜0.01，P＜0.05)。結扎組大鼠于輸液復蘇行腸系膜淋巴管結扎阻斷腸淋巴液回流后，不同器官在不同時間點肺、肝、心、腎等重要器官組織勻漿的MDA、NO含量、NOS、MPO活性、TNFα、IL-6水平雖顯著高于假手術組，且SOD活性顯著低于假手術組(P＜0.01，P＜0.05)； 3)休克淋巴液對PMVEC具有損傷作用。以不同終濃度的休克淋巴液、休克血漿、正常淋巴液、正常血漿等與PMVEC

14、孵育后，隨著休克淋巴液濃度的增加以及作用時間的延長，損傷作用逐漸增強，在一定范圍內，呈時間、劑量效應關系。4％的休克淋巴液作用PMVEC54h，部分細胞收縮、變圓，脫落細胞增加，10％終濃度的休克淋巴液作用12h全部細胞幾乎均破碎成片狀；休克血漿對PMVEC也有一定的損傷作用，但作用明顯弱于休克淋巴液。流式細胞儀檢測結果顯示：4％休克淋巴液作用PMVEC4h后，出現(xiàn)亞二倍體凋亡峰，休克淋巴液誘導的凋亡的百分率為(35.2±1.4)％，明

15、顯高于其它各組(P＜0.01)；細胞周期分析顯示，G0/G1期細胞比值增大，S、G2/M期細胞比值下降。結果提示休克淋巴液的抑制大鼠PMVEC增殖，促進細胞凋亡、壞死的作用。 4)以4％終濃度的休克淋巴液、休克血漿與PMVEC孵育6h，與其它各組比較，促凋亡相關基因bax、Fas、FasL以及炎癥介質TNFα、IL-6、iNOS的mRNA表達顯著增強，抑制凋亡基因bcl-2以及VEGF的mRNA表達顯著降低(P＜0.01，P＜0

16、.05)；而休克淋巴液組的bax、Fas、FasL、TNFα、IL-6、iNOS的mRNA表達顯著高于休克血漿組，且bcl-2、VEGF的mRNA表達顯著低于休克血漿組(P＜0.01)。對休克淋巴液、休克血漿、正常淋巴液、正常血漿毒性物質檢測的結果顯示：休克淋巴液中內毒素、TNFα、IL-6含量顯著高于休克血漿、正常淋巴液及正常血漿(P＜0.01)。結果提示，休克淋巴液對PMVEC的損傷作用與上調促炎介質和促凋亡基因表達、下調抑凋亡基因

17、及VEGF表達以及休克淋巴液中高濃度的內毒素、TNFα、IL-6有關。 結論1)結扎腸系膜淋巴管，阻斷休克大鼠的淋巴液回流，可提高失血性休克大鼠的存活率，改善器官功能及組織學損傷，其機制與減少腸源性內毒素移位、降低自由基損傷、NO、TNFα、IL-6的釋放及表達、減少中性粒細胞扣押有關。 2)休克淋巴液具有損傷PMVEC的作用，且損傷作用顯著強于休克血漿，其機制與休克淋巴液誘導PMVEC凋亡、上調炎癥介質TNFα、IL-