食管鱗癌中miR-451和miR-21表達及對生長、侵襲和凋亡的影響.pdf

1、背景和目的:
　　食管癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)生以鱗癌為主。盡管現(xiàn)在我國對食管鱗癌的診斷及治療水平有很大提高，但食管鱗癌由于早期的侵襲轉(zhuǎn)移使其臨床進展迅速預(yù)后較差，尤其是河南省林州市，是著名的食管癌高發(fā)區(qū)。由于大多數(shù)患者就診時已屬中晚期，不能手術(shù)，且放化療并未能明顯延長患者的生存期，因此從分子水平探討食管癌發(fā)生發(fā)展，為從基因水平上防治該病具有重要的現(xiàn)實意義和理論價值。
　　非蛋白質(zhì)編碼微小RNA(microRNA，m

2、iRNA)是具有調(diào)控功能的非編碼RNA，其大小長約20～25個核苷酸，廣泛存在于真核生物中并能通過與靶標基因mRNA上的3'UTR區(qū)特異結(jié)合來調(diào)節(jié)靶標基因的翻譯或者保持其穩(wěn)定性。研究發(fā)現(xiàn)miRNA參與了調(diào)控細胞增殖和凋亡，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中扮演了重要的角色，類似于抑癌基因和癌基因的功能。越來越多的miRNA被發(fā)現(xiàn)在多種惡性腫瘤中異常表達，包括白血病、大腸癌、肺癌、乳腺癌、腦癌及前列腺癌等。其中miR-451和miR-21是消化道腫瘤

3、的研究熱點。
　　miR-451位于染色體17q11.2，參與調(diào)控了多種生理及病理過程，如:造血系統(tǒng)分化、上皮細胞極性的形成、胚胎成熟、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、腫瘤形成及心血管疾病的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)miR-451在多種腫瘤組織中表達異常，并且參與了某些腫瘤的生物學(xué)行為和耐藥基因的調(diào)控。miR-21屬單基因編碼，其編碼基因位于17q23，長度為22個核苷酸，參與了細胞的增殖、分化和凋亡，研究發(fā)現(xiàn)miR-21與大多數(shù)的腫瘤有關(guān)。通過對腫瘤組織或癌

4、細胞株中miRNA表達譜的研究發(fā)現(xiàn)，miR-21在肝細胞癌、結(jié)腸癌、胃癌、膽管癌、乳腺癌、肺癌、B細胞淋巴瘤等多種腫瘤中比癌旁正常組織表達明顯增高，證實其在腫瘤形成過程中具有促進癌細胞浸潤和轉(zhuǎn)移的功能。然而miR-451和miR-21在食管鱗癌中的表達及對生長、侵襲和凋亡的影響、調(diào)控的分子機制仍然不是很清楚。鑒于此，本課題擬首先研究miR-451和miR-21在食管鱗癌中的表達，然后觀察調(diào)控miR-451和miR-21表達對食管鱗癌細胞

5、EC-9706生長、侵襲和凋亡的影響，并初步探討miR-451和miR-21影響細胞生長、侵襲和凋亡的分子機制。
　　本課題包括以下三部分:第一部分:食管鱗狀細胞癌組織中miRNA異常表達及與臨床病理特征相關(guān)性分析;第二部分:體內(nèi)外調(diào)控miR-451和miR-21表達對食管鱗癌細胞系EC9706生長、侵襲和凋亡的影響;第三部分:miR-451和miR-21靶基因及腫瘤抑制作用機制的初步研究。
　　第一部分食管鱗狀細胞癌組織中

6、miRNA異常表達及與臨床病理特征相關(guān)性分析
　　方法:
　　1.收集標本，包括53例食管鱗狀上皮細胞癌組織與53例配對的癌旁組織標本。
　　2.運用AgilentmiRNA芯片檢測3例食管鱗狀上皮細胞癌組織與配對的癌旁組織標本中miRNA表達情況，并對差異表達基因進行初步功能分析。
　　3.運用qRT-PCR檢測53例標本中12種miRNA表達情況水平，包括3個食管癌中表達上調(diào)的miRNA(miR-21，miR

7、-125a-3pandmiR-503)和9個食管癌中表達下調(diào)的miRNA基因(miR-429，miR-133b，miR-451，miR-139-5p，miR-133a，miR-127-3p,miR-210,miR-199a-5pandmiR-199b-5p)。
　　4.依據(jù)miR-21和miR-451表達水平，運用雙變量相關(guān)性分析其與食管癌病人性別、年齡、腫瘤分化、TNM分期及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間的相關(guān)性。
　　5.統(tǒng)計學(xué)分析

8、:所有實驗數(shù)據(jù)均使用SPSS17.0統(tǒng)計軟件包，多項指標間采用單因素方差分析，兩指標間進一步比較采用LSD-t檢驗;計量資料采用t檢驗;差異性分析用配對x2檢驗;相關(guān)性檢驗用Spearman相關(guān)分析，以α=0.05為顯著性水準。
　　結(jié)果:
　　1.AgilentmiRNA芯片檢測分析得到199個差異表達的miRNA基因，其中有103個(52％)差異表達基因為上調(diào)miRNA基因，96個(48％)基因為下調(diào)miRNA基因。mi

9、R-451在食管鱗癌組織中低表達，miR-21在食管鱗癌組織中商表達。
　　2.qRT-PCR結(jié)果顯示在12種miRNA中只有miR-503驗證結(jié)果和基因芯片結(jié)果不一致，其余11種miRNA兩種方法(Agilent基因芯片和qRT-PCR)得到的結(jié)果具有很好的一致性，證實了芯片數(shù)據(jù)的可靠性。
　　3.通過雙變量相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)食管癌組織中miR-451和miR-21的表達水平與有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、食管癌分化程度及TNM分期相關(guān)（P

10、＜0.05），與病人的年齡、性別和腫瘤部位無相關(guān)性(P＞0.05）。
　　第二部分體內(nèi)外調(diào)控miR-451和miR-21表達對食管鱗癌細胞系EC9706生長、侵襲和凋亡的影響
　　方法:
　　1.分別合成miR-451mimics、miR-21inhibitor和miRNAscramble，選用對數(shù)生長期EC9706按照實驗分組分別使用LipofectamineTM2000進行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染。
　　2.運用熒光定量R

11、T-PCR和Western-blot檢測各實驗組細胞中腫瘤生長、轉(zhuǎn)移和凋亡相關(guān)基因Bcl-2、AKT、CDKN2D、FasL和TIMP3mRNA和蛋白水平表達。
　　3.Transwell侵襲實驗法檢測EC-9706細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。
　　4.CCK-8試劑盒檢測EC-9706細胞增殖和生長能力。
　　5.流式細胞儀檢測EC-9706細胞周期變化和細胞凋亡情況。
　　6.裸鼠移植瘤實驗檢測體內(nèi)水平調(diào)控miR-4

12、51和miR-21表達對食管癌的影響。
　　7.統(tǒng)計學(xué)分析:利用SPSS17.0軟件，計量資料采用t檢驗;RealTimePCR結(jié)果及腫瘤質(zhì)量組間比較采用方差分析。以P＜0.05做為有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.miR-451mimics組的miR-451的相對表達量是15.84±3.07，對比空白對照組，表達水平顯著上調(diào)(P＜0.01);miR-21inhibitor組的miR-21的相對表達量是0.14±0.

13、02，對比空白對照組，表達水平顯著下調(diào)(P＜0.01)。
　　2.miR-451mimics組細胞Bcl-2、AKT和CDKN2D表達均顯著下調(diào)(P＜0.05）;miR-21inhibitor組的FasL和TIMP3表達水平顯著上調(diào)(P＜0.01)。
　　3.miR-451mimics組平均侵襲細胞數(shù)為47.4±7.4，與對照組比較顯著降低（P＜0.01）。miR-21inhibitor組的平均侵襲細胞數(shù)為24.1±3.1，

14、與對照組比較顯著降低(P＜0.01)。
　　4.miR-451mimics組和miR-21inhibitor組細胞的生長在轉(zhuǎn)染2d后出現(xiàn)顯著抑制（P＜0.05），并且隨時間的延長而日益顯著。
　　5.miR-451mimics組G0/G1細胞比例增加至74.89％，S細胞比例顯著降低至15.84％，G2/M期細胞比例顯著降低至9.27％，與對照組比較差異具有顯著性(P＜0.05)。
　　6.miR-451組細胞凋亡率為

15、(12.07±1.12)％，與對照組比較顯著升高（P＜0.01）;miR-21inhibitor組細胞凋亡率為(12.89±1.28)％，與對照組比較顯著升高(P＜0.01)。
　　7.miR-451mimics組腫瘤體積為616.41±49.52mm3，顯著低于對照組腫瘤體積(P＜0.01);miR-21inhibitor組腫瘤體積394.36±31.41mm3，顯著低于對照組腫瘤體積(P＜0.01）。
　　第三部分miR

16、-451和miR-21靶基因及腫瘤抑制作用機制的初步研究
　　方法:
　　1.通過生物信息學(xué)分析推測miR-451和miR-21的靶基因。
　　2.構(gòu)建野生和突變型重組載體pmirGLO-CDKN2D、pmirGLO-TIMP3和pmirGLO-FASL，采用Westernblot和雙熒光素酶報告實驗驗證miR-451和miR-21的靶基因。
　　3.構(gòu)建缺3'UTR的表達載體pcDNA3.1-CDKN2D、pc

17、DNA3.1-TIMP3和pcDNA3.1-FASL，通過restore方法分析CDKN2D、TIMP3和FASL對EC9706細胞周期、侵襲和凋亡的影響。
　　結(jié)果:
　　1.通過生物信息學(xué)分析推測TIMP3及FASL為miR-21靶基因，CDKN2D為miR-451靶基因。
　　2.食管鱗癌細胞EC9706中，共轉(zhuǎn)染miR-451mimics和野生型3'UTR區(qū)的pmirGLO-CDKN2D重組載體時，細胞的螢光素

18、酶活性顯著受到抑制（P＜0.05），提示miR-451可以通過作用于CDKN2D的3'UTR區(qū)，負向調(diào)控其表達。
　　3.食管鱗癌細胞EC9706中，共轉(zhuǎn)染miR-21mimics和野生型3'UTR區(qū)的pmirGLO-TIMP3重組載體時，細胞的螢光素酶活性顯著受到抑制(P＜0.05);共轉(zhuǎn)染miR-21inhibitor和野生型3'UTR區(qū)的pmirGLO-TIMP3重組載體時，細胞的螢光素酶活性顯著升高（P＜0.05）。提示m

19、iR-21可以通過作用于TIMP3的3'UTR區(qū)，負向調(diào)控其表達。
　　4.食管鱗癌細胞EC9706中，共轉(zhuǎn)染miR-21mimics和野生型3'UTR區(qū)的pmirGLO-FASL重組載體時，細胞的螢光素酶活性明顯受到抑制(P＜0.05);共轉(zhuǎn)染miR-21inhibitor和野生型3'UTR區(qū)的pmirGLO-FASL重組載體時，細胞的螢光素酶活性顯著升高(P＜0.05)，提示miR-21可以通過作用于FASL的3'UTR區(qū)，負

20、向調(diào)控其表達。
　　5.細胞周期實驗結(jié)果顯示:僅轉(zhuǎn)入無3'UTR區(qū)的pcDNA3.1-CDKN2D表達載體時G0/G1細胞比例數(shù)較Scramble對照組明顯降低，S期細胞比例顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）;共轉(zhuǎn)染miR-451mimics和pcDNA3.1-CDKN2D表達載體時，S期和G0/G1細胞比例數(shù)對比僅轉(zhuǎn)入無3'UTR區(qū)的pcDNA3.1-CDKN2D表達載體時細胞S期和G0/G1細胞比例數(shù)無顯著改變，差異無

21、統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　6.細胞侵襲實驗結(jié)果顯示:僅轉(zhuǎn)入無3'UTR區(qū)的pcDNA3.1-TIMP3表達載體時的穿過基底膜的細胞數(shù)較Scramble空白對照組明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);共轉(zhuǎn)染miR-21mimics和無3'UTR區(qū)的pcDNA3.1-TIMP3表達載體時，穿過基底膜的細胞數(shù)對比僅轉(zhuǎn)入無3'UTR區(qū)的pcDNA3.1-TIMP3表達載體時穿過基底膜的細胞數(shù)無顯著性改變(P＞0.05)。

22、r>　　7.凋亡檢測實驗結(jié)果顯示:僅轉(zhuǎn)入無3'UTR區(qū)的pcDNA3.1-FASL表達載體時，食管癌細胞EC9706的細胞凋亡數(shù)較Scramble空白對照組顯著增高(P＜0.05，);共轉(zhuǎn)染miR-21mimics和pcDNA3.1-FASL表達載體時，細胞凋亡數(shù)對比僅轉(zhuǎn)入pcDNA3.1-FASL表達載體時的細胞凋亡數(shù)沒有顯著性差異（P＞0.05）。
　　結(jié)論:
　　1.本研究在食管癌組織中一共篩選分析得到199個差異表達

23、的miRNA基因，其中有103個(52％)差異表達基因為上調(diào)miRNA基因，96個(48％)基因為下調(diào)miRNA基因。miR-451在食管鱗癌組織中低表達，miR-21在食管鱗癌組織中高表達。食管癌組織中miR-21和miR-451的表達水平與有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、食管癌分化程度及TNM分期相關(guān)，與病人的年齡、性別和腫瘤部位無相關(guān)性。
　　2.上調(diào)食管癌EC9706細胞中miR-451表達可有效抑制食管癌EC9706細胞的增殖和侵襲能力

24、，并且促進細胞的凋亡;下調(diào)食管癌EC9706細胞中miR-21表達能抑制食管鱗癌細胞系EC9706細胞的生長和侵襲，并促進其凋亡。
　　3.證實TIMP3及FASL為miR-21靶基因，CDKN2D為miR-451靶基因。miR-451通過作用于靶基因CDKN2D的3'UTR參與調(diào)控食管鱗癌細胞生長周期;miR-21通過作用于靶基因TIMP3的3'UTR參與調(diào)控食管鱗癌細胞侵襲;miR-21通過作用于靶基因FASL的3'UTR參與