脂肪源性干細胞對大鼠坐骨神經(jīng)損傷修復(fù)作用及其相關(guān)機制的研究.pdf

1、周圍神經(jīng)損傷后的修復(fù)是外科領(lǐng)域的一大難題?，F(xiàn)代化交通和工業(yè)的迅速發(fā)展以及重大的自然災(zāi)害都是周圍神經(jīng)損傷的重要因素,發(fā)生率越來越高的周圍神經(jīng)損傷給人們的日常生活帶來巨大痛苦并給社會帶來巨大的經(jīng)濟負擔。較小的神經(jīng)缺損可作端-端縫合,較大的缺損無法做端-端吻合則需要用移植物代替。但是后者存在很多缺點,如需要多次手術(shù)、犧牲健康神經(jīng)并造成供體部位的功能缺失。如今,組織工程技術(shù)的發(fā)展為治療周圍神經(jīng)缺損提供了新的策略。
　　 因為具有自我增殖

2、速度快并且具有多向分化潛能的特征,間充質(zhì)干細胞(Mesenchymal stem cells,MSC)成為一種十分具有吸引力的組織工程種子細胞來源。大量實驗表明,骨髓來源的間充質(zhì)干細胞(bone marrow-derived mesenchymalstem cell,BMMSC)能夠促進周圍神經(jīng)再生。同時,有研究發(fā)現(xiàn)大鼠BMMSC表達神經(jīng)營養(yǎng)因子(neurotrophic factor,NF),包括神經(jīng)生長因子(NGF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)

3、因子(BDNF)、睫狀節(jié)神經(jīng)細胞營養(yǎng)因子(CNTF)和膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF),并且BMMSC促進周圍神經(jīng)損傷修復(fù)的機制與神經(jīng)營養(yǎng)因子有關(guān)。另一項研究也認為,BMMSC對腦損傷的保護作用主要是其神經(jīng)營養(yǎng)因子的合成。
　　 然而,BMMSC的取材是一個高侵害的過程,并且骨髓中的間充質(zhì)干細胞的比例相對較低,因此急需尋找它的替代來源。
　　 近年來,另外一種間充質(zhì)干細胞一脂肪源性干細胞(adipose-derived

4、stem cell,ADSC)成為組織工程的研究熱點。與BMMSC相比,除了具有相似的表型和基因表達特征外,ADSC還具有其獨特的優(yōu)勢:①人類具有豐富的皮下脂肪,來源廣泛;②能夠通過安全的常規(guī)吸脂術(shù)獲得,取材方便;③脂肪組織中的間充質(zhì)干細胞的比例高于骨髓;④ADSC增殖速度快于BMMSC。
　　 既然ADSC具有這些優(yōu)勢,是否可以說ADSC就是一種理想的神經(jīng)組織工程種子細胞昵?有一系列問題擺在我們面前:①ADSC是否能夠合成和分

5、泌NF;②ADSC是否能夠促進周圍神經(jīng)損傷的修復(fù);③ADSC是否能在同種異體動物體內(nèi)長時間存活;④如果ADSC能夠促進周圍神經(jīng)損傷的修復(fù),那么其機制可能是什么?
　　 目的：
　　 本實驗將在體外原代培養(yǎng)ADSC并在細胞水平檢測各種NF的表達情況,另外以ADSC為種子細胞,以脫細胞神經(jīng)同種異體移植物(acellular nerve allografts,ANA)為支架構(gòu)建組織工程神經(jīng)應(yīng)用到大鼠坐骨神經(jīng)缺損模型,來觀察AD

6、SC是否具有促進神經(jīng)再生的作用,并進一步探討其機制。
　　 實驗方法：
　　 一、ADSC的分離、培養(yǎng)和鑒定
　　 采用3-4周的雄性Wistar大鼠,從腹股溝獲得脂肪組織,應(yīng)用酶消化法分離ADSC,并培養(yǎng)至第三代。
　　 取第三代ADSC分別在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基和成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進行培養(yǎng),觀察其形態(tài)的改變。茜素紅染色和油紅O染色分別鑒定ADSC向骨細胞和脂肪細胞分化的能力。
　　 二、ADSC和BM

7、MSC的增殖檢測
　　 應(yīng)用噻唑藍(MTT)比色法,分別對第一代和第三代ADSC、BMMSC繪制生長曲線,對二者進行比較。
　　 三、ADSC細胞水平的檢測
　　 (一)神經(jīng)營養(yǎng)因子(NF)
　　 應(yīng)用RT-PCR和ELISA方法分別在mRNA和蛋白水平檢測ADSC神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達。
　　 (二)神經(jīng)細胞粘附分子(NCAM)
　　 應(yīng)用免疫細胞化學方法觀察ADSC是否表達NCAM。

8、>　　 四、組織工程神經(jīng)的制備
　　 (一)ANA的制備
　　 Wistar大鼠,經(jīng)麻醉后取出兩側(cè)的坐骨神經(jīng),采用化學萃取脫細胞方法制備ANA,作為神經(jīng)組織工程支架。
　　 (二)移植細胞的標記
　　 應(yīng)用PKH-26熒光染料標記ADSC。
　　 (三)組織工程神經(jīng)移植物
　　 取標記后的ADSC,用微量注射器按照接種濃度為1×106/mL注入到脫細胞神經(jīng)支架內(nèi)并置于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)聯(lián)合培

9、養(yǎng)3天,備用。
　　 五、實驗動物、分組和手術(shù)
　　 雄性Wistar大鼠48只(200-250g,由中國醫(yī)科大學實驗動物部提供)按照實驗設(shè)計分為3組,即DMEM組(支架內(nèi)單純注射培養(yǎng)基)、ADSC組(支架內(nèi)注射ADSC和培養(yǎng)基)和自體移植組。
　　 用長10mm組織工程神經(jīng)橋接于大鼠右側(cè)坐骨神經(jīng)10mm缺損處。自體移植組將切斷的1cm的神經(jīng)翻轉(zhuǎn)180度過來縫合。
　　 六、檢測手術(shù)12周后坐骨神經(jīng)功能恢

10、復(fù)情況
　　 (一)行為學檢測
　　 足跡實驗檢測大鼠坐骨神經(jīng)功能指數(shù)(sciatic function index,SFI),觀察其神經(jīng)功能恢復(fù)情況。
　　 (二)電生理檢測
　　 應(yīng)用神經(jīng)電圖儀描記電位,檢測神經(jīng)傳導(dǎo)速度、潛伏期和波幅,從神經(jīng)電生理角度觀察其功能恢復(fù)情況。
　　 (三)脛骨前肌濕重比
　　 檢測脛骨前肌濕重比,從其靶器官的角度觀察其功能恢復(fù)情況。
　　 (四)形

11、態(tài)學檢測
　　 甲苯胺藍染色觀察再生神經(jīng)的有髓纖維數(shù)目、軸索直徑和髓鞘厚度,透射電鏡觀察髓鞘變性恢復(fù)情況。
　　 七、移植細胞的檢測
　　 12周時應(yīng)用免疫組織熒光方法檢測移植物內(nèi)PKH-26標記的ADSC發(fā)出的熒光信號,以確定移植細胞是否在宿主體內(nèi)存活。
　　 八、神經(jīng)移植物內(nèi)NF的檢測
　　 應(yīng)用RT-PCR法檢測術(shù)后3天和12周神經(jīng)移植物內(nèi)NF的表達,進一步探討ADSC促進周圍神經(jīng)修復(fù)的機制

12、。
　　 九、統(tǒng)計學分析
　　 各組實驗重復(fù)三次。實驗數(shù)據(jù)以-x±S表示,應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析和處理。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 實驗結(jié)果：
　　 一、ADSC的多向分化能力
　　 ADSC具有成脂和成骨潛能揭示其干細胞的特征,并且ADSC比BMMSC增殖快。
　　 二、ADSC細胞水平特征
　　 ADSC表達NGF、BDNF、NT-3、GDNF、

13、CNTF和LIF等NF和NCAM。
　　 三、ADSC能夠促進坐骨神經(jīng)再生
　　 ADSC能夠促進坐骨神經(jīng)再生,通過以下方面證明:①足跡分析證明大鼠行為學方面的提高;②脛前肌濕重比的提高;③神經(jīng)傳導(dǎo)速度和波幅的增加,潛伏期縮短;④移植物內(nèi)有髓神經(jīng)纖維數(shù)目、髓鞘厚度和軸索直徑的增加。
　　 四、ADSC的追蹤
　　 免疫熒光發(fā)現(xiàn)的PKH-26熒光信號提示在ADSC移植12周后在宿主體內(nèi)存活。
　　

14、五、移植物內(nèi)NF的表達
　　 在術(shù)后3天,在ADSC組神經(jīng)移植物內(nèi)檢測NF的表達,然而在DMEM組沒有檢測到。12周后,ADSC組的神經(jīng)營養(yǎng)因子中BDNF、NT-3和GDNF表達高于DMEM組,具有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)論：
　　 1、ADSC表達NF和NCAM,提示其具有促進神經(jīng)再生的潛能。
　　 2、ADSC能夠在宿主組織內(nèi)存活較長時間并且能夠促進神經(jīng)再生,提示ADSC是一種理想的神經(jīng)組織工程種子細胞