MDM2在腎小管間質(zhì)纖維化中的作用及機(jī)制.pdf

1、目的：通過(guò)小鼠單側(cè)輸尿管梗阻模型探討MDM2在腎小管間質(zhì)纖維化（tubulointerstitial fibrosis，TIF）進(jìn)程中的作用及機(jī)制。
　　方法：
　　（1）在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)MDM2在腎小管間質(zhì)纖維化中的表達(dá)情況：采取單側(cè)輸尿管結(jié)扎梗阻（unilateral ureter obstruction，UUO）構(gòu)建TIF模型，造模7天后取腎組織標(biāo)本。用免疫組化方法檢測(cè)假手術(shù)組和UUO組α-SMA、FN的表達(dá)

2、部位和表達(dá)量，用Masson染色檢測(cè)纖維化區(qū)域所占比例以證實(shí)造模成功。通過(guò)Western Blot和免疫組化檢測(cè)假手術(shù)組和UUO組MDM2蛋白表達(dá)情況以觀察MDM2蛋白在TIF時(shí)的在體表達(dá)情況。通過(guò)Western Blot檢測(cè)腎成纖維細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞在對(duì)照組和TGF-β1刺激后12h、24h、48h時(shí)MDM2蛋白表達(dá)情況以觀察MDM2蛋白在TIF時(shí)的離體表達(dá)情況。
　?。?）在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中探討阻斷MDM2-p53通路對(duì)TIF的影

3、響：將小鼠分為4組（n=5）：假手術(shù)+空白溶劑組、假手術(shù)+nutlin-3干預(yù)組、UUO手術(shù)+空白溶劑組、UUO手術(shù)+nutli n-3干預(yù)組。干預(yù)組選擇造模前1天作為起始時(shí)間點(diǎn)，采用nutli n-3腹腔注射以抑制MDM2作用，每日腹腔注射2次，連續(xù)注射7天。空白溶劑組采用同等體積的DMSO按與干預(yù)組相同的時(shí)間點(diǎn)、時(shí)長(zhǎng)和頻次進(jìn)行腹腔注射。7天注射結(jié)束后第2天處死小鼠并取腎組織標(biāo)本。用Western Blot檢測(cè)4組小鼠MDM2表達(dá)量以

4、及用Western Blot及免疫組化檢測(cè)4組小鼠p53表達(dá)量以確定nutlin-3發(fā)揮作用。用Western Blot和免疫組化檢測(cè)α-SMA以及用免疫組化檢測(cè)FN的表達(dá)以了解MDM2-p53通路被阻斷后對(duì)TIF的影響，用Masson染色再次評(píng)估阻斷MDM2-p53通路對(duì)TIF的影響。
　?。?）初步探索Notch1在TIF中的作用：用Western Blot和免疫組化檢測(cè)假手術(shù)組和UUO組小鼠腎組織中Notc h1的表達(dá)。

5、r>　　結(jié)果：
　　(1)通過(guò)Masson染色和免疫組化檢測(cè)α-SMA、FN的表達(dá)證實(shí)了UUO模型造模成功；在UUO模型小鼠腎臟和TGF-β1刺激的NRK-49F細(xì)胞以及NRK-52E細(xì)胞中MDM2表達(dá)上調(diào)；
　　(2)用nutlin-3阻斷MDM2-p53通路使得p53表達(dá)水平上調(diào)，但對(duì)小鼠腎臟MDM2的表達(dá)無(wú)明顯影響；阻斷MDM2-p53通路對(duì)UUO模型中α-SMA、FN的表達(dá)及腎臟纖維化程度無(wú)明顯影響；
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