Decorin-Fusin雙基因修飾對骨髓間充質(zhì)干細胞修復肝損傷能力的影響.pdf

1、肝損傷后纖維化形成(Fibrosis following liver injury，F(xiàn)FLI)是發(fā)病率日益增加、廣泛威脅著人類健康的世界范圍性疾病。
　　 FFLI的特征有兩方面：一、以特別是I型膠原為主的細胞外基質(zhì)(ECM)合成增多、降解減少，過多沉積在肝內(nèi)；二、功能性肝細胞的相對體積、絕對數(shù)量明顯減少，與此同時，肝星狀細胞(HSC)激活。
　　 研究證明，在FFLI發(fā)生機制中，HSC是ECM大量產(chǎn)生的主要細胞來源，是

2、FFLI發(fā)生與發(fā)展的中心環(huán)節(jié)。肝實質(zhì)細胞受損是HSC激活的始動因素；HSC多種刺激中，TGF-β1及其主導的Smads通路處于FFLI中的中心位置。
　　 抗FFLI理想策略應包含三部分：(1)阻止肝內(nèi)纖維合成；(2)刺激肝組織內(nèi)再生細胞的分裂；(3)損傷肝組織結(jié)構(gòu)的重建。
　　 目前，基于對FFLI分子機制的認識，基因治療的基本策略一般可以從以下幾方面著手：第一，以TGF-β1等絲裂原為靶位點，抑制HSC的激活從而減少

3、膠原合成；第二，以MMPs及TIMPs為靶位點，促進ECM降解；第三，抑制炎癥反應，保護肝細胞。基因治療文獻總結(jié)分為：(1) HGF為靶向(2)針對MMPs及其抑制劑TIMPs(3)針對間質(zhì)炎癥(4) HSC為靶向治療(5)針對uPA的方法(6)端粒酶方法(7)肝干細胞為靶向的治療(8)以TGF-β1為靶向的基因治療(9)針對RNA干擾技術的途徑。
　　 研究證明，核心蛋白聚糖(DCN)能調(diào)節(jié)膠原合成等，對防止組織纖維化的發(fā)生起

4、重要作用；DCN能結(jié)合并滅活TGF-β1，調(diào)節(jié)其生物利用度。
　　 Fusin是CXC家族成員之一，與CXCR4的生物學特性一致。在損傷肝組織中，某些趨化因子及其相應受體如基質(zhì)細胞衍生因子-1α(SDF-1α)和CXC趨化受體-4(SDF-1α/CXCR4)間的相互作用對表達相應趨化因子和受體的外源性細胞如骨髓衍生間充質(zhì)干細胞(BMdMSCs)起趨化作用。
　　 BMdMSCs與HSC之間存在雙向相互影響的現(xiàn)象。有證據(jù)顯

5、示，BMdMSCs可以抑制HSC的激活，而激活的HSC需要BMdMSCs橫向分化成新的肝細胞，從而刺激內(nèi)源性實質(zhì)細胞的更新，增強ECM的降解。
　　 如何使BMdMSCs在已具備有損傷肝細胞更新能力基礎上，使之同時獲得并發(fā)揮抗纖維合成的能力呢?
　　 也許對其進行分子生物學干預手段的基因修飾不失為一種好的選擇。
　　 目前，雙基因修飾BMdMSCs的文獻報道較少，相關性研究的大部分集中將一個目的基因和一個報告基因

6、如綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)入靶細胞以便追蹤目的基因表達情況。采用蛋白水解及纖維連接蛋白追蹤法以及轉(zhuǎn)染技術將DCN及Fusin最終導入BMdMSCs，目前尚未見到同類文獻報道；聯(lián)合采用DCN及Fusin并通過分子干預手段修飾BMdMSCs的方式來進行FFLI聯(lián)合基因治療，目前也尚未見到同類文獻報道。
　　 本實驗包含兩部分，每部分的研究目的分述如下：
　　 第一部分：Decorin/Fusin雙基因修飾對BMdMSCs趨化及抗纖維合

7、成能力的體外實驗研究。目的：(1)觀察通過蛋白水解及纖維連接蛋白追蹤法構(gòu)建攜帶DCN及Fusin的嵌合體融合基因慢病毒表達載體，并將其導入BMdMSCs的可行性；(2)觀察修飾BMdMSCs是否能夠同步、穩(wěn)定表達導入的兩種基因；(3)通過體外趨化動力學以及Transwell纖維合成實驗，觀察在特定環(huán)境下，修飾BMdMSCs體外趨化動力學以及趨化穿基質(zhì)膠膜后的抗纖維合成能力。
　　 第二部分：茲標記Decorin/Fusin雙基因

8、修飾BMdMSCs大鼠損傷肝內(nèi)活體MRI追蹤及功能評價。目的：將PLL介導的SPIO茲標記雙基因修飾BMdMSCs，標記后的細胞經(jīng)門靜脈植入藥物性FFLI大鼠體內(nèi)。(1)通過MRI掃描探討茲標記后修飾BMdMSCs大鼠肝內(nèi)的分布情況；(2)通過術后纖維化量分析間接評價修飾BMdMSCs大鼠體內(nèi)后的生物學特性。
　　 第一部分 Decorin/Fusin雙基因修飾對BMdMSCs趨化及抗纖維合成能力的體外實驗研究
　　 一

9、、實驗方法
　　 1、BMdMSCs的分離、鑒定；
　　 2、攜帶嵌合體融合基因重組慢病毒表達載體質(zhì)粒的構(gòu)建；
　　 3、慢病毒小包裝、病毒滴度測定及病毒轉(zhuǎn)染BMdMSCs；
　　 4、修飾BMdMSCs后融合基因及其相關蛋白的檢測；
　　 5、雙基因修飾BMdMSCs的趨化動力學及趨化、穿膜后增殖變化；
　　 6、Transwell體外纖維合成實驗。
　　 二、實驗結(jié)果
　

10、　 1、BMdMSCs培養(yǎng)30小時后，表面抗原CD34、Thy-1、GSTπ均陽性表達。病毒滴度達1×107cfu/ml；基因轉(zhuǎn)染效率抗性篩選后達30％。
　　 2、經(jīng)鼠anti-His抗體免疫印跡檢測、流式細胞儀Simultest檢測、RTPCR確定了兩個目的基因mRNA水平表達，而且為同步表達。
　　 3、與空載體組相比較，修飾BMdMSCs自Boyden或Transwell小室趨化動力學因下室不同處理而改變；SD

11、F-1α處理后趨化、穿膜后貼壁活性增加，且呈劑量依賴性(p＜0.05)。
　　 4、Transwell細菌膠原酶消化法結(jié)合流式細胞技術顯示Ⅰ型膠原、α-SMA均明顯表達，PDGF條件下的表達更顯著(p＜0.05)。
　　 第二部分磁標記decorin/fusin雙基因修飾BMdMSCs大鼠損傷肝內(nèi)活體MRI追蹤及功能評價
　　 一、實驗方法
　　 1、復合多因素肝纖維化模型的制備、術前標本留取；
　

12、　 2、體外磁標記修飾BMdMSCs的鑒定以及標記后的增殖評價；
　　 3、實驗分組、術前后血清、組織學檢測及術后大鼠肝臟MRI掃描；
　　 4、術后Ⅰ型膠相對含量和密度檢測——纖維化量分析。
　　 二、實驗結(jié)果
　　 1、模型成功率約95％、誘導時間13周、模型穩(wěn)定。術中死亡率10％；13周后模型大鼠肝組織HE切片：可見小葉周邊破壞嚴重、廣泛橋架壞死、假小葉分成獨立的細胞團。
　　 2、Pru

13、ssian blue染色結(jié)果顯示，幾乎每個標記的修飾BMdMSCs胞質(zhì)內(nèi)均有數(shù)量不等的陽性藍染致密顆粒，未標記細胞無藍染顆粒、呈陰性。
　　 3、體外茲標記修飾BMdMSCs移植大鼠體內(nèi)后，術后受試大鼠肝組織普魯士藍染色見聚集、呈陽性藍染的鐵顆粒細胞。
　　 4、與術前相比較，茲標記雙基因修飾組大鼠肝組織內(nèi)隨著術后時間延長，肝組織HYP含量、Ⅰ型膠原相對含量逐步降低，說明肝組織內(nèi)雙基因修飾BMdMSCs在肝損傷部位的歸巢

14、、生長及增殖活性持續(xù)存在。
　　 三、結(jié)論
　　 1、本實驗首次成功構(gòu)建攜帶DCN及Fusin的嵌合體融合基因重組慢病毒表達載體pLTR-CMV-FIB-Fusin-RKRRKR-DCN質(zhì)粒，首次將DCN及Fusin導入BMdMSCs，使修飾BMdMSCs兼有雙重效應的生物學行為。
　　 2、本實驗結(jié)果證明，DCN及Fusin雙基因修飾BMdMSCs是可行的；修飾BMdMSCs可穩(wěn)定、同步表達Fusin及DCN。

15、DCN及Fusin雙基因轉(zhuǎn)染BMdMSC的轉(zhuǎn)染效率為30％，說明重組慢病毒與BMdMSCs之間存在良好的相互作用；但所測定的轉(zhuǎn)染效率和國際領先研究小組的報道(有的報道稱轉(zhuǎn)染效率＞90％)相比較仍有差距。
　　 3、本實驗首次聯(lián)合使用DCN及Fusin并通過分子干預手段及轉(zhuǎn)染技術修飾BMdMSCs。通過體外實驗證實，F(xiàn)usin/Decorin雙基因修飾BMdMSCs既表現(xiàn)有強的趨化能力，也表現(xiàn)有抗纖維合成能力。
　　 4、

16、Transwell纖維合成實驗結(jié)果表明，在不同微環(huán)境下，雙基因修飾BMdMSCs有可能發(fā)生結(jié)構(gòu)性適應性變化，能夠從一個穩(wěn)定的趨化因子樣結(jié)構(gòu)狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橐粋€纖維合成抑制劑樣結(jié)構(gòu)狀態(tài)。
　　 5、PLL介導SPIO磁標記Decorin及Fusin雙基因修飾BMdMSCs植入大鼠體內(nèi)后，T2*WI序列MRI掃描追蹤到了其在損傷肝內(nèi)產(chǎn)生的低信號密度區(qū)。
　　 6、纖維量結(jié)果提示，磁標記修飾BMdMSCs植入大鼠體內(nèi)后，對Ⅰ型、TG