miR-128-2骨髓嵌合和轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立及其免疫表型分析.pdf

1、microRNAs（miRNAs）是真核生物中一類長度約為22個核苷酸，參與基因轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控的非編碼小分子RNA。近年來研究發(fā)現(xiàn)，MiRNAs參與了眾多的生物學過程，如細胞的增殖分化和凋亡、個體發(fā)育和疾病的發(fā)生發(fā)展?，F(xiàn)有的研究表明MiRNAs同樣參與了免疫系統(tǒng)的各種細胞的分化發(fā)育。為進一步探討miRNAs在淋巴細胞發(fā)育和活化中的作用，我們首先初步研究在部分淋巴細胞（monocytes、proB細胞、T細胞等）中miRNAs的表達差異。

2、結(jié)果發(fā)現(xiàn)在不同細胞，甚至同一種細胞的不同發(fā)育階段中，其 miRNAs的表達譜呈現(xiàn)顯著的差異。仔細分析miRNAs在不同免疫細胞中的表達譜，我們發(fā)現(xiàn)miR-128-2在DP T細胞中表達與其它檢測的細胞有非常顯著的差異。由此，在本課題中我們設(shè)想通過建立miR-128-2嵌合小鼠模型和miR-128-2轉(zhuǎn)基因小鼠模型來進一步研究miR-128-2在淋巴細胞分化發(fā)育中的作用。為此，首先我們通過 q-PCR和流式分析鑒定miR-128-2過表達

3、的質(zhì)粒pmscv-GW-Rfa-eGFP-miR-128-2能成功表達miR-128-2。在此基礎(chǔ)上，為更好的研究miR-128-2對淋巴細胞發(fā)育的影響，我們一方面通過制備miR-128-2的逆轉(zhuǎn)錄病毒，感染骨髓干細胞，并建立miR-128-2過表達嵌合小鼠模型，通過FACS和PCR檢測證明我們的嵌合小鼠模型成功建立。另一方面，為得到更好的穩(wěn)定的研究模型，我們將pmscv-GW-Rfa-eGFP-miR-128-2用ScaI酶切線性化，

4、并應(yīng)用顯微注射受精卵細胞制備miR-128-2轉(zhuǎn)基因小鼠模型，經(jīng)PCR檢測發(fā)現(xiàn)，我們得到5只miR-128-2陽性小鼠模型。同時，我們通過構(gòu)建miR-128-2的海綿 miRNAs表達質(zhì)粒（pMDH-PGK-GFP-miR-128-2-sponge），并建立miR-128-2-sponge嵌合小鼠和轉(zhuǎn)基因小鼠模型，觀察阻滯miR-128-2的表達對淋巴細胞發(fā)育的影響。進一步通過FACS分析發(fā)現(xiàn)：不管在嵌合小鼠中，還是在轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，

5、我們均發(fā)現(xiàn)過表達miR-128-2后，其T細胞及各種T細胞亞群的比例和其在正常小鼠中發(fā)育無顯著差異。但我們發(fā)現(xiàn)在過表達嵌合小鼠和轉(zhuǎn)基因小鼠中，不管是在骨髓還是在外周的脾臟中，均出現(xiàn) B細胞的顯著減少。而miR-128-2-sponge的嵌合小鼠和轉(zhuǎn)基因小鼠 B細胞比例輕度升高。由此我們認為miR-128-2在造血細胞的發(fā)育中主要影響了B細胞發(fā)育，且呈現(xiàn)為對B細胞的發(fā)育阻滯作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)過表達 miR-128-2后，并不影響B(tài)細胞的

6、自我更新和凋亡，而是通過阻滯CLP向PreProB發(fā)育來實現(xiàn)的。最后，我們通過軟件分析和PCR、熒光素酶素報告系統(tǒng)等預測miR-128-2在B細胞發(fā)育阻滯中的作用機制，初步發(fā)現(xiàn)，miR-128-2可能通過作用于多種基因如 BCL11a、MALT、A2b等來調(diào)控B細胞的發(fā)育。其詳細機制有待我們進一步探討。
　　總結(jié)我們現(xiàn)有的研究，我們成功建立了miR-128-2過表達嵌合小鼠和轉(zhuǎn)基因小鼠動物模型，及 miR-128-2-sponge